青海省海西州藏系綿羊鼠疫調查分析

李積成，祁美英，代瑞霞，楊漢青，熊浩明，靳　娟，楊曉艷，楊永海，趙小龍，魏柏青

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青海省海西州藏系綿羊鼠疫調查分析

李積成，祁美英，代瑞霞，楊漢青，熊浩明，靳娟，楊曉艷，楊永海，趙小龍，魏柏青

青海省地方病預防控制所鼠疫預防控制科，西寧811602

摘要：目的對青海省海西州開展藏系綿羊鼠疫病原學和血清流行病學調查，了解當地藏系綿羊鼠疫流行情況。方法應用鼠疫間接血凝試驗(IHA)、膠體金紙上色譜(GICA)兩種方法，對該地區1 813份藏系綿羊血清進行了檢測；對分離自當地藏系綿羊的1株鼠疫菌進行生化試驗、毒力測定、毒力因子鑒定、質粒分析、差異片段(DFR)分型等研究。結果采用IHA和GICA方法分別對所采集的1 813份藏系綿羊血清進行檢測，均檢出鼠疫Fl抗體陽性血清15份，陽性率為0.83%。其中，從德令哈市檢出陽性血清7份，3份滴度為1∶20，3份滴度為1∶40, 1份滴度為1∶80；烏蘭縣檢出陽性血清8份，滴度均為1∶20。同時，證實鼠疫菌株的生態型為青藏高原型，毒力因子及毒力檢測結果顯示該株鼠疫菌為強毒菌，基因型(DFR )為8型，質粒譜6×106、45×106、52×106 。結論該地區存在藏系綿羊鼠疫流行，所分離的鼠疫菌株具備青藏高原鼠疫病原體特性。因此，應加強藏系綿羊鼠疫的監測工作，尤其是旱獺鼠疫流行地區。

關鍵詞：鼠疫；藏系綿羊；血清流行病學；病原學；海西蒙古族藏族自治州

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1975年8月，青海省玉樹州玉樹市上拉秀地區首次證實了藏系綿羊﹙以下簡稱藏羊﹚能自然感染鼠疫并成為人類鼠疫的傳染源[1]，以后陸續從該州的囊謙、雜多以及海西州的德令哈市藏羊體內分離出鼠疫菌。到目前為止，青海省自藏系綿羊材料中分離出鼠疫菌14株，由藏羊引發的人間鼠疫有10起，發病25人，死亡13人。無論是從鼠疫菌的分離數量還是作為傳染源引發的人間鼠疫病例，藏羊的流行病學意義僅次于旱獺而位于第2位[2]。近年來，隨著交通條件的改善和發展，海西州境內青藏鐵路大部分路段都處于鼠疫疫源地，且這塊疫源地是我國最活躍、鼠疫菌毒力最強的鼠疫疫源地之一，因此，海西州的鼠疫防控工作是近十幾年來全省乃至全國關注的焦點，由于藏羊鼠疫來自旱獺鼠疫，且每年還有相當數量的未經深加工的藏羊畜產品(例如生肉、皮張等)運往全國各地，為非疫源地區輸入藏羊鼠疫創造了一定條件。 因此，藏羊鼠疫存在的現實風險是不能忽視的。為了解海西蒙古族藏族自治州藏羊鼠疫流行狀況，我們對該地區藏羊鼠疫血清流行病學及病原學特征進行了調查研究，現將結果報告如下。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株與資料來源1996年8月從海西州德令哈市郭里木地區藏羊鼠疫分離出1株鼠疫菌株，由青海省地方病預防控制所國家鼠疫菌種保藏中心提供。藏羊鼠疫背景資料由青海省鼠疫防治信息資源庫提供。

1.1.2藏羊血清及樣本處理2013-2014年采集海西州藏系綿羊血液樣本1 813份，其中德令哈市275份，格爾木市204份，烏蘭縣538份，都蘭縣210份，天峻縣206份，茫崖、冷湖、大柴旦行政委員會共380份。將藏系綿羊血液樣本進行血清分離、低溫分裝， 56 ℃水浴、30 min滅活，-20 ℃保存備用。

1.1.3實驗動物為昆明系小白鼠，清潔級，30只，質量18～20 g，由青海省實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1毒力測定按常規方法進行菌株毒力測定,計算最小致死量(MLD)，并參照朱錦沁等[3]對青海省鼠疫菌株毒力等級進行分類。

1.2.2細菌表型特征按常規方法進行鼠疫菌生化、糖醇類酵解試驗、毒力因子等表型特征的研究，根據傳統的鼠疫菌生態型6項指標進行鼠疫菌生態型分析[4]。

1.2.3質粒分析參照文獻[5]的方法進行，質粒DNA相對分子質量(Mr)的測定采用標準質粒對照法。

1.2.4鼠疫菌DNA的提取DNA提取按照經典的苯酚-氯仿混合抽提法進行[5]。

1.2.5細菌差異片段(different region，DFR)分型用23對DFR(DFR01～DFR23)分型引物和PMT1(質粒驗證引物)，同時檢索中國鼠疫菌DFR分型數據庫[6-7]，對被試菌株DNA進行分型驗證，以91001、620024菌株DNA的等量混合物為陽性對照，同時設置陰性對照，引物序列及結果分析參見文獻[6-7]。

1.2.6血清檢測方法鼠疫間接血凝試驗(IHA)、膠體金紙上色譜(GICA)方法參照《鼠疫診斷標準》(WS279—2008) 及附錄E、F。

2結果

2.1藏羊鼠疫菌病原學特征

2.1.1藏羊鼠疫菌生化特性1株被試菌株均能分解阿膠糖、麥芽糖和甘油，不分解鼠李糖及密二糖，脫氮陽性，生態型為青藏高原型。

2.1.2藏羊鼠疫菌毒力測定及毒力因子試驗對1株被試鼠疫菌小白鼠毒力測定，MLD為1 000個菌，毒力因子試驗顯示，均能產生莢膜抗原(Fl)、鼠疫桿菌素I(PstI)、毒力抗原因子(VW)、色素沉著因子(Pgm)，為強毒株。

2.1.3藏羊鼠疫菌質粒譜試驗顯示，該株鼠疫菌攜帶有3種質粒，相對分子質量(Mr)分別為6×106、45×106、52×106。

2.1.4藏羊鼠疫菌基因型檢索中國鼠疫菌DFR分型數據庫，23個DFR 和PMT1 進行PCR擴增后顯示，該菌株為8型。

2.2血清學調查采用IHA和GICA兩種方法分別對所采集的1 813份藏系綿羊血清進行檢測，均檢出鼠疫Fl抗體陽性血清15份，陽性率為0.83%。其中，德令哈市檢出陽性血清7份，3份滴度為1∶20，3份滴度為1∶40, 1份滴度為1∶80；烏蘭縣檢出陽性血清8份，滴度均為1∶20。見表1。

3討論

海西州位于青海省西北部,是青、甘、新、藏四省區交往的中心地帶。境內平均海拔3 500～4 000 m,面積30萬km2，人口48.9萬。1957年該州天峻縣首次自喜馬拉雅旱獺體內分離出鼠疫菌,判定為鼠疫自然疫源地，以后陸續判定都蘭、烏蘭、格爾木、冷湖、茫崖、德令哈為疫源縣(市、行委)。據疫史資料統計，該地區發生兩起由藏羊引起的人間鼠疫。1956年天峻縣多石科地區發生肺鼠疫流行，首發患者切羅于7月15日剝食病死藏羊，7月25日發病，癥狀為高燒、咳嗽、咯血痰、胸痛，未經治療于7月27日死亡；因看護、探望、埋尸體等先后接觸的13人發病(癥狀同切羅)，死亡11人。1961年都蘭縣熱水鄉第二牧業隊發生肺鼠疫流行，首發患者松日普于10月15日剝病死藏羊2只，肉被14人分食。10月18日松日普發病，初為腹部不適、腹瀉、繼之發燒、咳嗽、咯泡沫狀血痰，未經治療于10月23日死亡；因食用同一病死藏羊肉或密切接觸松日普等有10人相繼發病，9人死亡，并從1具尸體中分離出鼠疫菌。此外，1996年8月從海西州德令哈市郭里木地區病死藏羊分離出鼠疫菌1株，證實該地區存在藏羊鼠疫流行。王祖鄖等[7]2005年對海西州青藏鐵路沿線藏羊鼠疫進行了血清流行病學調查，對采集的1 523份藏羊血清進行檢測，共檢出鼠疫Fl抗體陽性血清4份，其中滴度1∶40的3份、1∶80的1份，陽性率2．6‰。藏羊鼠疫對人民群眾身體健康和經濟發展仍然存在潛在威脅，因此藏羊鼠疫防治應該引起高度重視。

表1　GICA和IHA檢測海西州藏系綿羊血清實驗結果

本次試驗結果顯示，采用IHA和GICA方法分別對1 813份藏羊血清進行檢測，檢出鼠疫Fl抗體陽性血清15份，陽性率0.83%。從德令哈市檢出陽性血清7份，烏蘭縣檢出陽性血清8份，可以看出，局部地區存在藏羊鼠疫的流行。2001年青藏鐵路格拉段開工建設以來,根據工程衛生保障的要求,連續14年在全州境內鐵路沿線開展了鼠疫監測工作。德令哈市2002、2011年從旱獺體內分離到鼠疫菌，烏蘭縣除2013年外每年都從旱獺體內分離到鼠疫菌。因藏羊分布區與旱獺的自然分布區基本上重疊，加之藏羊與人類生活生產關系密切，因此，在旱獺鼠疫流行地區，藏羊鼠疫的監測工作更不能忽略。

本研究顯示，從藏羊鼠疫所分離的1株鼠疫菌生態型為青藏高原型；鼠疫菌毒力測定MLD為1 000個菌，鼠疫菌四個毒力因子俱全，該株鼠疫菌為強毒菌，質粒譜及基因型表明該菌株具備青藏高原鼠疫病原體特性。藏羊對旱獺鼠疫菌呈現非常顯著的個體差異，屬于高感受中等敏感動物[1]。人類感染藏羊鼠疫后同樣具有發病急、病情重、傳染性強、病死率高等特點，因此，藏羊鼠疫流行對人類威脅極其嚴重。

海西州的鼠疫流行歷史悠久，疫源地分布廣泛，除大柴旦外，其余各市、縣、行委都有分布。海西州最近的人間鼠疫發生于2004年，烏蘭縣相繼發生2起人間鼠疫，發病2人，死亡1人、治愈1人，隱性感染2人[9]，由于礦產、旅游資源豐富，境內有青藏鐵路和青藏公路穿過，交通比較發達，人口流動頻繁，存在鼠疫遠距離傳播的危險，值得高度重視。此外，改良綿羊、牦牛、藏羊等家畜動物參與鼠疫流行，使鼠疫流行演變出流行周期延長、傳播途徑更復雜、易感人群基數增加、對人類危害更加嚴重等許多新的特點。近年來陸續從西藏山羊、藏原羚、巖羊、牦牛等偶蹄類動物分離出鼠疫菌或檢測出鼠疫F1抗體[10]。本次調查發現許多牧民有食用病死羊的現象，因此，要廣泛開展健康教育活動，在旱獺鼠疫流行地區，除了及時處理旱獺動物間疫情外，禁止在旱獺鼠疫流行區域放牧，在疫區牧民剪羊毛和屠宰期間(每年8月中旬和10月下旬)，更應加強對藏羊鼠疫的監測及各屠宰點的衛生監督工作，防止人間鼠疫的發生和鼠疫遠距離傳播。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.020

通訊作者：魏柏青，Email:wbq9@163.com

中圖分類號：R516.8

文獻標識碼：C

文章編號：1002-2694(2016)01-0099-03

Corresponding author:Wei Bai-qing, Email: wbq9@163.com

收稿日期：2015-04-22；修回日期:2015-10-15

Investigation and analysis of Tibetan sheep plague in Haixi Autonomous Prefecture, Qinghai Province, China

LI Ji-cheng,QI Mei-ying,DAI Rui-xia,YANG Han-qing,XIONG Hao-ming,JIN Juan,YANG Xiao-yan,YANG Yong-hai,ZHAO Xiao-long,WEI Bai-qing

(DepartmentofPlaguePreventionandControl,QinghaiInstituteforEndemicDiseasesPreventionandControl,Xining811602,China)

Abstract:We conducted the etiology and serology epidemiological investigation of Tibetan sheep plague in Haixi Autonomous Prefecture, in order to understand the epidemic trend of Tibetan sheep plague in this area. We applied both IHA and GICA methods to test 1 813 samples of Tibetan sheep serum and chose one Yersinia pestis strain isolated in this area for biochemical test, toxicity test, virulence factors evaluation, plasmid analysis, and DFR genotyping. We used these two kinds of methods for test of 1 813 samples of Tibetan sheep serum respectively, the results of positive FI antibody both had 15 samples of serum, positive rate was 0.83%. Delingha City had 7 positive serum samples, 3 titer were 1∶20, 3 titer were 1∶40 and the other one was 1∶80. Meanwhile, Wulan County had 8 positive serum sample, titers for both were 1∶20. We confirmed that the strain's ecotype were Qinghai-Tibet Plateau, and the results of virulence factors evaluation and toxicity test showed the strain was velogenic, genomovar(DFR) was genomovar8, plasmid spectrum was 6×106, 45×106, and 52×106, respectively. Haixi Mongolian Tibetan Autonomous Prefecture had the prevalence of Tibetan sheep plague, the strain separated from this area had the characteristics of Qinghai-Tibet plateau plague's pathogen. Therefore, the monitoring of Tibetan sheep plague should be strengthened, especially in Marmot plague epidemic areas.

Keywords:plague; Tibetan sheep; serum epidemiology; etiology; Haixi Mongolian Tibetan Autonomous Prefecture

國家自然科學基金(No.81260438)