2011-2013年河南省鼠傷寒沙門菌耐藥與分子分型研究

趙嘉詠，黃麗莉，穆玉姣，謝志強，蘇　佳，張白帆，夏勝利，許汴利

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2011-2013年河南省鼠傷寒沙門菌耐藥與分子分型研究

趙嘉詠，黃麗莉，穆玉姣，謝志強，蘇佳，張白帆，夏勝利，許汴利

河南省疾病預防控制中心，鄭州450016

摘要：目的分析2011-2013年河南省鼠傷寒沙門菌臨床分離株的耐藥狀況與脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型帶型，為以鼠傷寒沙門菌為代表的食源性疾病暴發預警、調查、溯源及公共衛生意義上的抗生素使用策略提供基線與參考數據。方法根據國際PulseNet 細菌性傳染病分子分型監測網絡公布的沙門菌PFGE分型技術與美國臨床與實驗室標準協會(CLSI)沙門菌K-B法藥敏測試方案，對2011-2013年分離自我省5個哨點醫院的72株鼠傷寒沙門菌進行13種抗生素的藥敏測試與PFGE分子分型分析。結果72株沙門菌對8類13種抗生素均有不同程度的耐藥，有65株為多重耐藥菌株(90.3%)，其中耐3～5種的為6株(8.3%)，耐6～8種的為34株(47.2%)，耐9～10種的為10株(13.9%)。72株鼠傷寒沙門菌經Xba Ⅰ酶切與脈沖場凝膠電泳后，獲得45種帶型，每種帶型包含菌株數1～9株不等，相似度區間為65.6%～100%。結論河南省臨床分離的鼠傷寒沙門菌耐藥狀況普遍比較嚴重，PFGE帶型呈現出多樣性的同時又具有較顯著的優勢帶型特點，部分帶型與其對應的耐藥譜具有一定的關聯性與相同的聚集性。

關鍵詞：鼠傷寒沙門菌；PFGE；分子分型；藥敏測試

Supported by the by the National Science and Technology Major Projects "AIDS and Viral Hepatitis and Other Major Infectious Diseases Prevention and Control"(Nos. 2012ZX10004201 and 2012ZX10004203)

沙門菌屬是一種重要的人獸共患病原菌，也是近幾年來食源性傳染病暴發疫情的常見與主要病原。根據Kauffman-White血清分型表可以分為2 700多個血清型，其中鼠傷寒沙門菌是我國臨床最常見的沙門菌致病血清型，其在動物、食品和低齡兒童中的感染率與致病力都很高。目前K-B法藥敏測試與脈沖場凝膠電泳(Pulse-field gel electrophoresis,PFGE)是國際上公認的食源性疾病研究與暴發調查、溯源的重要手段，被廣泛應用于沙門菌及其他腸道腹瀉病的多病原綜合監測工作中[1-2]。本研究對3年內分離自河南省的72株鼠傷寒沙門菌進行藥敏測試與大片段DNA分子特征分析，為深入了解鼠傷寒沙門菌的多重耐藥及分子特性，指導臨床合理用藥和腸道傳染病的防控提供科學依據。

1材料與方法

1.1菌株來源自2011-2013年河南省腹瀉病多病原監測系統中收集并分離自病人的72株鼠傷寒沙門菌，其中2011年37株，2012年32株，2013年3株。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑沙門菌科瑪嘉鑒定培養基(法國CHROMAgar)、腦心浸液/M-H瓊脂及藥敏紙片(英國OXOID)、API20E腸桿菌科細菌鑒定板條(法國bioMérieux公司)、沙門菌診斷血清(丹麥SSI公司)、藥敏紙片分配器(英國OXOID公司)、Seakem Glod瓊脂糖(美國LONZA公司)、蛋白酶K(英國Roche公司)、限制性內切酶XbaI(大連寶生物公司)、Tris-HCl/EDTA/5XTBE(solarbio公司)。

1.2.2主要儀器VITEK濁度儀(法國bioMérieux公司)、去離子水系統(美國Milipore公司)、SHZ-C型水浴搖床(上海博迅儀器)、三溫水浴鍋(北京東方精瑞)、Minispin臺式離心機(德國Eppendorf)、脈沖場凝膠電泳系統(美國Bio-Rad公司)、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1菌株的生化鑒定與血清分型從沙門菌科瑪嘉平板上直接挑取淡紫色菌落轉種腦心浸液平板，37 ℃培養16～18 h，0.85%生理鹽水制備0.5麥氏濁度菌液，API20E腸桿菌科系統生化鑒定，確定為沙門菌后用沙門菌診斷血清進行O相玻片凝集分型，再利用0.4%營養軟瓊脂(參見WHO沙門菌鑒定手冊)進行H相(1/2相)鞭毛誘導與血清凝集，生理鹽水做自凝對照。根據K-W血清分型表確定對應血清型別。

1.3.2藥敏試驗參照WHO推薦的Kirby-Bauer法，將鼠傷寒沙門菌轉種腦心浸液瓊脂平板，37 ℃培養16 h后0.85%生理鹽水制成0.5麥氏單位懸液。用無菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布于M-H平板表面，用分配器將藥敏紙片壓蓋其上，15 min內送37 ℃溫箱培養18 h以后測量各藥敏紙片抑菌圈直徑，參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2009年標準進行耐藥表型判定，大腸桿菌ATCC25922作為質控菌株[3]。

1.3.3PFGE分型按照國際Pulsenet網絡實驗室與美國CDC公布的沙門菌脈沖場凝膠電泳標準分型方法，對72株鼠傷寒沙門菌菌株進行分子分型，沙門菌標準株H9812作為分子量標記[4]。限制性內切酶XbaI(50U)，37 ℃酶切2 h。電泳參數：電壓6 V/cm，脈沖時間2.2～63.8 s，線性轉換，電場角度120°，電泳時間19 h，電泳液溫度14 ℃。電泳結束后膠塊用GelRed染料染色20 min后純水清洗30 min后凝膠成像儀拍照(曝光時間3.0 s，去過飽和成像)。

1.3.4數據分析用BioNumerics6.0軟件對電泳圖譜進行數據分析，繪制聚類分析樹狀圖。聚類算法為非加權配對平均法(UPGMA)，電泳條帶位置優化度(Position tolerance)1.5%，相似度100%認定為同一PFGE帶型。

2結果

2.1背景資料分析72株鼠傷寒沙門菌男女比例1.5∶1(43∶29)，以男性為主；年齡分布以0～5歲低齡兒童為主(52,72.6%)，尤其以6個月到2歲嬰幼兒為主(37,51.2%)；分離時間多集中于每年的5-10月。

2.2藥敏測試結果72株鼠傷寒沙門菌對廣譜合成類青霉素氨芐西林(AMP)的耐藥率為57.14%，對三代頭孢類抗生素頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)的耐藥率為30.95%，對四代頭孢類抗生素頭孢吡肟(FEP)的耐藥率為9.52%；對一代喹諾酮類抗生素萘啶酸(NAL)的耐藥率為54.76%，對三代氟喹諾酮類抗生素環丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NOR)的耐藥率為11.90%；對氨基糖苷類抗生素慶大霉素(GEN)、鏈霉素(STR)的耐藥率為63.10%；對氯霉素類抗生素(CHL)的耐藥率為38.10%；對增效磺胺類抗生素甲氧芐氨嘧啶(TMP)與復方新諾明(SXT)的耐藥率為32.14%和68.1%；對四環素(TET)的耐藥率為53.57%。72株鼠傷寒沙門菌中耐2種以上抗生素的多重耐藥菌株為65株(90.3%)，其中耐3-5種的為6株(8.3%)，耐6-8種的為34株(47.2%)，耐9-10種的為10株(13.9%)。具體數據見表1、2。

表1　72株鼠傷寒沙門菌抗生素藥敏檢測結果一覽表

表2　72株鼠傷寒沙門菌多重耐藥譜

2.3PFGE分子分型結果72株鼠傷寒沙門菌經XbaⅠ酶切后共分為45種帶型(Dice,positiontolence1.5%),分別命名為TH1-TH45,帶型聚類分析見圖1。各帶型包含菌株數為1～9株不等，帶型相似度在65.6%～100%之間，其中TH6、TH12、TH27、TH38包含2株菌，TH18、TH26、TH40包含3株菌、TH16、TH22包含4株菌，TH19包含8株菌，為該血清型主要優勢帶型，其余33種帶型僅包含1株菌。72株鼠傷寒沙門菌PFGE帶型與耐藥譜之間的關系較為復雜，從型內看，TH16中4株菌的耐藥譜相同(AMP-GEN-TMP-NAL-CHL-SXT)，TH12中2株菌的耐藥譜相同(AMP-TMP-TET-STR-NAL-CHL-NOR-SXT)，TH19中5株菌的耐藥譜相同(AMP-TMP-CIP-TET-STR-NAL-CHL-NOR-SXT)；從型間看，不同帶型對應的菌株表現為相同的耐藥表型，如TH19中2株菌與TH18型內菌株耐藥譜相同(AMP-CTX-CIP-TET-NAL-CHL-NOR)，TH4中3株菌耐藥表型與TH40中1株菌表型(AMP-TMP-TET-STR-NAL-CHL-SXT)一致。在單菌株帶型對應的耐藥譜中，部分帶型耐藥表型一致，如TH15、TH42與TH44，其余帶型無一致性或耐藥譜呈現較高的相似性，見圖1。

圖1　72株鼠傷寒沙門菌PFGE聚類分析圖譜

3討論

3.1能引起人類食源性疾病的非傷寒沙門菌血清型眾多。從河南省近3年的監測數據看，位居前3位的血清型分別是鼠傷寒(S.typhimurium)、腸炎(S.enteritidis)和阿貢那(S.agona)或腸炎(S.enteritidis)、鼠傷寒(S.typhimurium)和森芬伯格(S.senftenberg)沙門菌。鼠傷寒沙門菌占據著主要位置。河南省鼠傷寒沙門菌血清型主要有1,4,5,12：i:1,5、1,4,5,12:i:1,2以及1,4,5,12:i:-。特別是1,4,5,12:i:-單H相菌近年來數量日益增多，已逐漸成為鼠傷寒沙門菌常見血清型，這與國內其他省份和歐美等國家的報道一致[5-6]。

3.2細菌耐藥是近年來醫療衛生機構面臨的重大問題。由于臨床過度治療與抗生素的濫用，病原菌的耐藥現象日益嚴重。從本研究藥敏測試結果可以看出，河南省以沙門菌為代表的腸道致病菌耐藥問題十分嚴重，其對8類13種抗生素均存在不同程度的耐藥，比較嚴重的有青霉素類、磺胺類、四環素類、氯霉素類、氨基糖苷類以及一代喹諾酮類，對臨床常用藥物三代喹諾酮類環丙沙星和諾氟沙星也存在一定的耐藥。沙門菌的多重耐藥情況也非常嚴重，臨床分離菌株普遍對3～10種抗生素耐藥，尤其是這些耐藥菌株大多分離自5歲以下的低齡兒童，更值得我們關注。這些多重耐藥表型的出現一方面歸因于病原菌的自發偶發性耐藥突變，但更重要的原因在于抗生素濫用產生的高選擇壓和耐藥基因的水平傳遞。眾所周知，目前細菌耐藥在我國和世界范圍內都已成為臨床和公衛衛生領域高度關注的問題，建立科學有效的細菌耐藥監測體系，及時分析分享數據，指導農業、畜牧業和醫療部門合理規范用藥，減緩細菌耐藥突變和擴散速度，降低臨床治療成本，是一件非常必要和迫切的事情。

3.3脈沖場凝膠電泳是近年來快速發展的傳染性病原菌分子分型技術，依托這種技術和網絡化實驗室實時監測、交換和比對數據，可以及時發現、識別聚集性病例，為食源性傳染病早期預測預警，暴發疫情與突發公共衛生事件的調查與現場處置提供了強有力的武器[7]。本研究利用該技術分析了我省鼠傷寒沙門菌PFGE“指紋圖譜”特征與優勢帶型，積累了分子流行病學基線數據并為同其他地區聯合開展相應疾病的分子流行病學比對和爆發溯源奠定了基礎。我們還注意到部分鼠傷寒沙門菌的耐藥表型與PFGE帶型呈現聚類一致性，這種現象提示我們基于共同暴露源的菌株往往具有相同的基因和耐藥表型特征，這種特征盡管存在變異性和不確定性，但在一定范圍內可以成為及早發現聚集性病例的重要指征參數。同時我們也要認識到只有結合病原學和流行病學信息，才能更好的把握疾病傳播特點和發揮PFGE技術在疾病防控、突發公衛事件/疫情處置中的作用。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.012

通訊作者：許汴利，Email：xubl@hncdc.com.cn

中圖分類號：R378

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0056-05

Corresponding author:Xu Bian-li, Email:xubl@hncdc.com.cn

收稿日期：2015-04-29；修回日期:2015-08-15

Characteristics of drug resistance and molecular typing research for Salmonella typhimurium isolated in Henan Province, 2011-2013

ZHAO Jia-yong,HUANG Li-li,MU Yu-jiao,XIE Zhi-qiang,SU Jia,ZHANG Bai-fan,XIA Sheng-li,XU Bian-li

(CenterforDiseaseControlandPreventionofHenanProvince,Zhengzhou450016,China)

Abstract:We investigated the antimicrobial resistance and pulsed field gel electrophoresis(PFGE) patterns of S. typhimurium strains in Henan Province isolated in five sentinel hospitals from 2011 to 2013, providing baseline and reference data for the early warning, investigation, traceability as well as antibiotic use strategy. According to molecular typing and Salmonella K-B drug susceptibility testing method published by the international PulseNet bacterial infectious disease monitoring network and USA clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI), we analyzed drug sensitivity and PFGE molecule characteristics of 72 S. typhimurium strains isolated from five sentinel hospitals. Results showed that 72 strains of S. typhimurium had different levels of resistance to 13 kinds of antibiotics, 65 strains were multidrug resistant strains(90.3%), 6 isolates were resistant to 3-5 kinds of antibiotics(8.3%), 34 isolates were resistant to 6-8 kinds of antibiotics(47.2%), 10 isolates were resistant to 9-10 kinds of antibiotics. A total of 72 strains of Salmonella typhimurium were divided into 45 molecular patterns by digestion with XbaI and pulsed field gel electrophoresis. Each pattern contained 1-9 strains with similarity ranged from 65.6%-100%. The situation of drug resistance of clinical isolates of Salmonella in Henan Province was rather serious, PFGE patterns showed both diversity and dominant belt type characteristics. The PFGE patterns of partial strains and its corresponding antidrug spectrum have certain relevance and the same aggregation relationship.

Keywords:S. typhimurium; PFGE; molecular typing; AST

國家科技重大專項《艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治》(No.2012ZX10004201和No.2012ZX10004203)