Krupple樣因子6調控誘導型一氧化氮合酶介導銅綠假單胞菌感染小鼠肺組織細胞凋亡的研究

喻志芳，韓 彬，柴文戍

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·論著·

Krupple樣因子6調控誘導型一氧化氮合酶介導銅綠假單胞菌感染小鼠肺組織細胞凋亡的研究

喻志芳，韓 彬，柴文戍

121001遼寧省錦州市，錦州醫科大學附屬第一醫院呼吸內科

【摘要】目的通過研究Krupple樣因子6(KLF6)在銅綠假單胞菌感染肺組織中表達水平的變化，探討KLF6調控誘導型一氧化氮合酶(iNOS)介導銅綠假單胞菌感染小鼠肺組織細胞凋亡的機制。方法于2014年10—12月，30只小鼠隨機分為對照組和低感染組，每組15只，低感染組注射銅綠假單胞菌1.0×107 CFU制作動物模型，感染后3、9、24 h，分別隨機取各組5只小鼠留取標本。另10只小鼠隨機分為中感染組和高感染組，每組5只，分別注射銅綠假單胞菌5.0×107、1.0×108 CFU，均在感染后9 h留取標本。在各時間點處死動物后無菌分離肺組織,左肺結扎后測定濕干重之比。采用TUNEL法檢測肺組織細胞凋亡指數，采用硝酸還原酶法測定一氧化氮(NO)水平,化學比色法測定iNOS活性，采用Western blotting法檢測肺組織KLF6水平。結果光鏡下可見低感染組小鼠肺組織大量炎性細胞浸潤,肺泡隔增厚，肺泡壁結構破壞，局部有肺泡膨脹不全或肺泡塌陷,并擴散到肺間質內，24 h時炎癥改變最為嚴重。3 h時,對照組和低感染組肺組織濕干重之比比較，差異無統計學意義(P>0.05)；9、24 h時，低感染組肺組織濕干重之比大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。低感染組不同時間肺組織凋亡指數比較，差異有統計學意義(P<0.05)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織凋亡指數比較，差異有統計學意義(P<0.05)。3、9、24 h時，低感染組肺組織NO水平、iNOS活性均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織NO水平、iNOS活性比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。低感染組不同時間肺組織KLF6表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織KLF6表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論銅綠假單胞菌感染能誘導KLF6的表達，并有可能通過iNOS調控介導細胞凋亡。

【關鍵詞】銅綠假單胞菌；Krupple 樣因子6；一氧化氮合酶；細胞凋亡

喻志芳，韓彬，柴文戍.Krupple樣因子6調控誘導型一氧化氮合酶介導銅綠假單胞菌感染小鼠肺組織細胞凋亡的研究[J].中國全科醫學，2016，19(20)：2435-2439.[www.chinagp.net]

YU Z F,HAN B,CHAI W S.KLF6 and iNOS regulated apoptosis during pseudomonas aeruginosa lung infection in mice[J].Chinese General Practice，2016，19(20)：2435-2439.

銅綠假單胞菌是自然環境中廣泛存在的革蘭陰性桿菌，可導致免疫功能低下者急性感染，有肺基礎疾病者慢性終生感染[1]。組織損傷時，一氧化氮(NO)作為細胞因子可使靶細胞凋亡，加強局部炎性反應，而誘導型一氧化氮則在感染后產生[2]。雖然感染銅綠假單胞菌時，NO是加重肺疾病的關鍵因素，但其在感染過程中誘導凋亡的機制尚未明確。已有研究表明，Krupple樣因子6(KLF6)在炎性反應的基因表達調控中發揮重要作用[3]，但其與銅綠假單胞菌所致組織細胞凋亡相關性研究較少。本文探討感染銅綠假單胞菌時KLF6的作用機制，為臨床治療提供新的方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑實驗動物來源于錦州醫科大學實驗中心SPF級昆明小鼠〔許可批號：SCXK(遼)2014-0004〕；銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853由錦州醫科大學附屬第一醫院檢驗中心贈送；TUNEL試劑盒購自Roche公司；KLF6(R-173)購自美國Santa cruz biotechnology,貨號SC-7158；NO試劑盒(硝酸還原酶法)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)測試盒購自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株配制于2014年10—12月，參考文獻[4]配制銅綠假單胞菌菌株，加1.0 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細菌,用分光光度比色法測定菌液的濃度，懸浮于無菌0.9%氯化鈉溶液調整至1.0×108CFU/ml備用。

1.2.2動物模型40只昆明小鼠，體質量20～30 g，雌雄各半，其中30只隨機分為對照組和低感染組，每組15只，在感染后3 、9 、24 h，分別隨機取各組5只留取標本。對照組小鼠不做處理。低感染組小鼠腹腔內注射體積分數為10%的水合氯醛0.6～1.0 ml麻醉，參考文獻[5]制作銅綠假單胞菌感染模型，每只小鼠注射銅綠假單胞菌1.0×107CFU。剩余10只隨機分為中感染組和高感染組，每組5只，分別注射銅綠假單胞菌5.0×107、1.0×108CFU，均在感染后9 h留取標本。在各時間點處死小鼠后無菌分離肺組織,左肺結扎后測定濕干重之比，結扎的右上葉肺組織用4%多聚甲醛固定液固定,行石蠟包埋、切片，剩余的部分右肺組織于-80 ℃儲存。

1.2.3肺組織濕干重之比的測定處死小鼠取肺時將左肺稱重，記為濕重。70 ℃烤箱中烘烤24 h后所稱重量記為干重，計算濕干重之比。

1.2.4肺組織病理學檢測將由4%多聚甲醛固定液固定后的肺組織行石蠟包埋和切片,隨機抽取1張切片行蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織的形態學改變,在400倍視野下連續觀察10 個不同視野。

1.2.5肺組織細胞凋亡檢測采用TUNEL法進行檢測，操作均按照試劑盒說明書進行。凋亡細胞胞核呈棕褐色顆粒狀，在400倍視野下，每張切片觀察10個視野，以凋亡細胞數量占同一視野中的細胞總數的百分比表示為凋亡指數。

1.2.6肺組織NO水平及iNOS活性的測定取出存放于-80 ℃凍存的肺組織，在4 ℃的0.9%氯化鈉溶液中漂洗,濾紙拭干,分析天平準確稱取重量后，加入9倍的0.9%氯化鈉溶液,制成質量分數為10%的組織勻漿，4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min(離心半徑為6 cm),取上清液按試劑盒說明書操作，用硝酸還原酶法測定NO水平,用化學比色法測定iNOS活性。

1.2.7肺組織KLF6表達水平的測定每0.01～0.02 g肺組織加入100～200 μl RIPA裂解液和1～2 ml PMSF，用剪刀剪碎肺組織，冰浴上超聲10 s，停20 s，反復20次，直至組織均勻，冰上靜置20 min，4 ℃條件下以12 000 r/min離心15 min(離心半徑為6 cm)，取上清液后經BCA法定量。取40 g蛋白上樣，完成一抗、二抗孵育后，加ECL顯色劑顯色，圖像掃描分析條帶,以灰度值表示KLF6的相對表達水平。

2結果

2.1外觀觀察對照組小鼠肺外觀呈粉紅色,無明顯異常改變；低感染組小鼠3 h時可見肺組織表面散在點狀出血，9、24 h肺體積增大,呈暗紅色,且有片狀出血。

2.2病理學觀察光鏡下可見低感染組小鼠肺組織大量炎性細胞浸潤,肺泡隔增厚，肺泡壁結構破壞，局部有肺泡膨脹不全或肺泡塌陷,并擴散到肺間質內，24 h時炎癥改變最為嚴重；而對照組各時間點肺泡結構完整，肺泡腔內清晰，肺泡間隔均一，肺泡、肺間質內無明顯炎性細胞浸潤(見圖1，本文彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

注：a為對照組肺組織病理切片，b～d分別為低感染組3、9、24 h肺組織病理切片

圖1兩組小鼠肺組織病理變化(HE染色，×400)

Figure 1Pathological changes of lung tissue of two groups

2.3肺組織濕干重之比3 h時,對照組和低感染組肺組織濕干重之比比較，差異無統計學意義(P>0.05)；9、24 h時，低感染組肺組織濕干重之比大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.4凋亡指數低感染組不同時間肺組織凋亡指數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著感染時間延長，肺組織凋亡指數呈增長趨勢(P<0.05,見表2)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織凋亡指數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著劑量的增加，肺組織凋亡指數呈增長趨勢(P<0.05,見表3)。

Table 1Comparison of wet and dry weight ratio between control group and low-infection group at different time points

組別只數3h9h24h對照組54.49±0.304.55±0.234.70±0.38低感染組54.77±0.166.38±1.087.94±1.29t值1.7803.7065.370P值0.1120.0210.006

Table 2Comparison of lung tissue apoptosis index of low-infection group among different time points

時間(h)凋亡指數316±2924±3a2434±3abF值54.520P值<0.001

注：與3 h比較，aP<0.05；與9 h比較，bP<0.05

Table 3Comparison of lung tissue apoptosis index at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

組別只數凋亡指數對照組58±1低感染組524±3a中感染組532±3ab高感染組541±3abcF值132.469P值<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與低感染組比較，bP<0.05；與中感染組比較，cP<0.05

2.5肺組織中NO水平和iNOS活性比較3、9、24 h時，低感染組肺組織NO水平、iNOS活性均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4、5)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織NO水平、iNOS活性比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，低感染組、中感染組和高感染組肺組織NO水平、iNOS活性高于對照組，中感染組和高感染組肺組織iNOS活性高于低感染組，高感染組肺組織iNOS活性高于中感染組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表6)。

2.6肺組織KLF6表達水平比較低感染組不同時間肺組織KLF6表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著感染時間延長，肺組織KLF6表達水平呈增長趨勢(P<0.05，見表7)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織KLF6表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著劑量的增加，肺組織KLF6表達水平呈增長趨勢(P<0.05，見表8)。

Table 4Comparison of NO level between control group and low-infection group at different time points

組別只數3h9h24h對照組51.13±0.521.40±0.39 1.66±0.39 低感染組52.84±0.368.43±1.1213.69±1.44t值6.10713.21718.059P值<0.001<0.001<0.001

Table 5Comparison of iNOS activity between control group and low-infection group at different time points

組別只數3h9h24h對照組50.21±0.110.25±0.150.31±0.10低感染組50.56±0.060.93±0.221.61±0.12t值6.1945.75918.779P值<0.001<0.001<0.001

Table 6Comparison of NO level and iNOS activity at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

組別只數NO(mmol/gprot)iNOS活性(U/mgprot)對照組51.40±0.390.25±0.15低感染組58.43±1.12a0.93±0.22a中感染組59.57±1.25a1.24±0.19ab高感染組511.07±1.47a1.64±0.23abcF值71.30042.186P值<0.001<0.001

注：NO=一氧化氮，iNOS=誘導型一氧化氮合酶；與對照組比較，aP<0.05；與低感染組比較，bP<0.05；與中感染組比較，cP<0.05

Table 7Comparison of the KLF6 expression of low-infection group among different time points

時間(h)KLF6349.52±2.04957.64±3.84a2469.01±3.50abF值46.130P值<0.001

注：KLF6=Krupple樣因子6；與3 h比較，aP<0.05；與9 h比較，bP<0.05

Table 8Comparison of KLF6 expression at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

組別只數KLF6對照組541.64±2.62低感染組557.64±3.84a中感染組569.57±3.01ab高感染組585.66±5.18abcF值120.520P值<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與低感染組比較，bP<0.05；與中感染組比較，cP<0.05

3討論

銅綠假單胞菌廣泛存在于土壤、水、空氣，以及正常人的皮膚、呼吸道、腸道，在人體是一種條件致病菌，易感染免疫力低下人群。由于人口老齡化、HIV廣泛傳播以及結核病復燃的趨勢，使得免疫力低下人群廣泛存在，加之抗生素濫用，面臨難治性銅綠假單胞菌感染的風險。

KLF6是Sp/Kruppel 樣鋅指轉錄因子家族成員之一，能夠參與調控細胞增殖、分化、胚胎發育等生命過程，并與腫瘤等多種疾病有關[6]。有研究表明，KLF6基因的表達受到多種生理過程的調控，并且被誘導表達的KLF6能調節應激過程[7-8]。BOTELLA等[9]研究進一步闡明了肝星狀細胞的激活、結構基因及細胞因子的刺激能誘導KLF6表達迅速增高。在氰化鈉誘導的缺氧時，原發性T淋巴細胞中KLF6的iNOS啟動子結合位點增加，導致增加內源性iNOS基因的表達，釋放更多的NO[10]。本研究中，小鼠感染銅綠假單胞菌后，肺組織明顯充血、水腫、大量炎性細胞浸潤，且隨著時間的延長，肺組織病理改變越重，濕干重之比也越高，KLF6表達水平升高，iNOS活性升高，NO水平升高，細胞凋亡指數增加，說明銅綠假單胞菌感染肺組織可誘導KLF6的表達，有可能通過調控iNOS產生NO增加細胞凋亡率。為進一步驗該推論，本研究對小鼠注射不同劑量銅綠假單胞菌，而隨著劑量的增加，KLF6表達水平升高，iNOS活性及NO水平亦明顯升高，進一步支持KLF6有可能通過調控iNOS產生NO增加細胞凋亡率。近年研究表明，NO的抗菌活性是通過作為吞噬細胞衍生的氧化劑而體現的，已知因素包括部分細胞因子和微生物產品調節iNOS的水平，iNOS活性的重要性是與宿主的防御和炎性反應一致[11]。

綜上所述，隨著肺組織炎癥的加重，肺組織KLF6表達水平升高，且隨著iNOS活性和NO水平升高，細胞凋亡指數增加，提示銅綠假單胞菌感染能誘導KLF6的表達，并有可能通過iNOS調控介導細胞凋亡，為治療銅綠假單胞菌感染提供新的思路。

作者貢獻：喻志芳進行課題設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；韓彬進行課題實施、評估、資料收集；柴文戍進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

KLF6 and iNOS Regulated Apoptosis During Pseudomonas Aeruginosa Lung Infection in Mice

YUZhi-fang,HANBin,CHAIWen-shu.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,China

【Abstract】ObjectiveTo research the changes of KLF6 expression in lung tissue with pseudomonas aeruginosa infection and investigate the mechanism of KLF6 and iNOS regulated apoptosis during pseudomonas aeruginosa lung infection in mice.MethodsFrom October to December in 2014,30 mice were randomly divided into control group and low-infection group,with 15 mice in each group.The low-infection group was injected with pseudomonas aeruginosa by 1.0×107 CFU to make models;5 mice were randomly selected respectively at 3,9 and 24 hours.Other 10 mice were divided into medium-infection group and high-infection group,with 5 mice in each group.Medium-infection group and high-infection group were infected with pseudomonas aeruginosa by 5.0×107 CFU and 1.0×108 CFU respectively,and samples were obtained 9 hours later.At each time point mentioned above,animals were killed to perform sterile separation of their lung tissue,and litigation was conducted on the left lung to determine wet and dry weight ratio.Lung tissue apoptosis index was detected using TUNEL method,and NO level was determined using nitrale reduetase method,iNOS activity was determined by chemical colorimetry.The KLF6 expression of lung tissue was detected by Western blotting.ResultsUsing the microscope,we observed much inflammatory cell infiltration,thickened alveolar septa,destroyed structure of the alveolar wall,and local alveolar atelectasis or alveolar collapse spreading to pulmonary interstitium;the inflammatory changes became the severest at 24 h.At 3 h,control group and low-infection group were not significantly different in wet and dry weight ratio(P>0.05);at 9 and 24 h,low-infection group was higher than control group in wet and dry weight ratio(P<0.05).There were significant differences in the lung tissue apoptosis index of low-infection group among different time points(P<0.05).There were significant differences in the lung tissue apoptosis index among different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused at 9 h(P<0.05).At 3,9 and 24 h,the low-infection group was higher than control group in NO level and iNOS activity(P<0.05).Different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused significant differences in NO level and iNOS activity at 9 h(P<0.05).There were significant differences in KLF6 expression of low-infection group among different time points(P<0.05).Different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused significant differences in KLF6 expression at 9 h(P<0.05).ConclusionPseudomonas aeruginosa infection can induce the expression of KLF6,and may mediate cell apoptosis by the regulation of iNOS.

【Key words】Pseudomonas aeruginosa；KLF6；Nitric oxide synthase；Apoptosis

基金項目：遼寧省自然科學基金資助項目(2014022015，20092189)

通信作者：柴文戍，121001遼寧省錦州市，錦州醫科大學附屬第一醫院呼吸內科；E-mail：cws1964@163.com

【中圖分類號】R 378.991

【文獻標識碼】A

DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.20.016

(收稿日期：2015-11-11；修回日期：2016-03-24)