川芎嗪對宮頸癌Hela細胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表達的影響

張　濤　宋慶嬌　榮光影　柳朝陽　汪　悅

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江　佳木斯　154007)

川芎嗪對宮頸癌Hela細胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表達的影響

張濤宋慶嬌榮光影1柳朝陽2汪悅3

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的研究川芎嗪(TMP)對Hela細胞磷酸化Bad(p-Bad)蛋白和Survivin蛋白表達的影響。方法四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法檢測TMP對Hela細胞增殖的抑制作用；流式細胞術檢測細胞凋亡率；Western印跡法檢測p-Bad和Survivin蛋白的表達。結果與對照組相比TMP可抑制Hela細胞的增殖(P<0.01)；增加Hela細胞的凋亡率(P<0.05，P<0.01)；降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表達(P<0.05，P<0.01)。結論TMP可抑制Hela細胞增殖，誘導Hela細胞凋亡，降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表達，這可能是TMP誘導Hela細胞凋亡的機制之一。

〔關鍵詞〕川芎嗪；宮頸癌；細胞凋亡；磷酸化Bad蛋白；Survivin蛋白

川芎嗪(TMP)是中藥川芎根莖中的生物堿單體，臨床上主要用于治療多種心血管疾病〔1，2〕。目前報道，TMP的抗腫瘤〔3～7〕作用主要見于對肺癌、白血病、黑色素細胞瘤和胃癌的抑制作用，TMP對宮頸癌的抑制及其作用機制國內外暫無報道。本實驗旨在探討TMP誘導Hela細胞凋亡的作用機制。

1材料與方法

1.1材料細胞株：Hela細胞株購于中國醫學科學院腫瘤研究所細胞庫。 藥物和試劑：TMP純品購于Sigma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)購于北京拜爾迪生物技術公司。AV-FITC凋亡檢測試劑盒、兔抗人Survivin抗體和抗人β-actin抗體、Bad蛋白磷酸化(p-Bad)抗體購于艾美捷科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養Hela細胞復蘇后，RPMI 1640培養基培養，37℃、5% CO2培養，選對數生長期時的細胞進行實驗。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖胰酶消化調整細胞濃度為1×104/ml，接種于96孔板，100 μl/孔，培養24 h，分別給予不同濃度的TMP(0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/ml)處理，每個濃度設4個復孔。分別處理(24、48、72)后進行檢測，加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl培養4 h，每孔加入200 μl DMSO，于490 nm處檢測吸光度(OD)值。同時設空白對照組，有細胞，無藥物。細胞增殖抑制率(IR)=(1-實驗組OD均值/對照組OD均值)×100%。

1.2.3膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V FITC)染色流式細胞儀觀察Hela細胞凋亡Hela細胞接種于培養瓶中常規培養，24 h后加入TMP(0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/ml)，培養24 h。根據試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測，利用FCSExpress 3.0軟件分析細胞凋亡。

1.2.4Western印跡法檢測Survivin及p-Bad蛋白表達收集對照組及TMP(1.0，1.5，2.0 mg/ml)處理的Hela細胞，提取總蛋白，用Bradford法測定各組蛋白質含量。蛋白上樣后，進行凝膠電泳，移膜，4℃用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入兔抗人抗體(1∶100)，過夜，加二抗(1∶10 000)，雜交1 h。采用ECL法分析檢測結果，以β-actin為對照蛋白，各組蛋白條帶進行灰度分析，計算Survivin和p-Bad蛋白表達水平。

1.3統計學處理采用SPSS11.3軟件進行單因素方差分析及LSD檢驗。

2結果

2.1TMP抑制Hela細胞增殖MTT法結果顯示，與對照組相比，不同濃度的TMP作用于Hela細胞可明顯抑制細胞的增殖(P<0.01)；各時間點均以2.0 mg/ml濃度的抑制率最高，具有劑量依賴性和時間依賴性。見表1。

2.2TMP對Hela細胞凋亡率的影響不同濃度的TMP作用于Hela細胞24 h后，與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，早期凋亡率、晚期凋亡率或壞死細胞逐漸上升(P<0.05，P<0.01)(0.25 mg/ml組除外)，具有濃度依賴性，見表2。

2.3TMP對Hela細胞p-Bad蛋白及Survivin蛋白表達的影響與對照組相比，不同濃度的TMP作用于Hela細胞48 h后，可見隨藥物濃度的增高，p-Bad蛋白及Survivin蛋白的表達逐漸降低，呈一定的濃度依賴性，見表3。

表1　不同濃度的TMP對Hela細胞增殖的影響

與對照組比較:1)P<0.01

表2　TMP對Hela細胞凋亡的影響

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

表3　TMP對Hela細胞磷酸化Bad蛋白和Survivin

與對照組比較:1)P<0.01；與TMP 0.25 mg/ml組比較:2)P<0.01；與TMP 1.0 mg/ml組比較:3)P<0.05

3討論

宮頸癌是嚴重威脅婦女生命健康的惡性腫瘤之一，死亡率占女性癌癥的第二位〔8〕。研究證明，500 mg/L TMP對人胃低分化腺癌有一定殺傷作用，抑制率約為24.4%～28.5%〔3〕；TMP能輕度抑制敏感性白血病K562細胞的DNA合成〔4〕；≥250 mg/L的TMP對體外培養的B16-FIO黑色素瘤細胞DNA、RNA和蛋白質合成具有抑制作用，并存在劑量依賴關系〔5〕；TMP對肺癌A549細胞有明顯的增殖抑制作用，機制可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡來實現的〔6〕；TMP通過誘導Bel-7402肝癌細胞株分化抑制細胞增殖〔7〕。本實驗結果顯示，TMP能夠抑制Hela細胞增殖及誘導細胞凋亡。

Bad是 Bcl-2家族中的促凋亡基因。Bad在多種細胞中表達，研究表明Bad可通過與Caspase家族成員的相互作用和作用于細胞信號轉導通路參與細胞凋亡全過程。接受細胞凋亡信號刺激后，鈣調磷酸酶可誘導 Bad去磷酸化，去磷酸化的游離 Bad 通過易位等細胞活動促進凋亡的發生〔9〕。

Bad蛋白對凋亡的調控與其磷酸化-去磷酸化修飾有關，生理狀態下，p-Bad一方面與 14-3-3 蛋白結合成復合物穩定存在于胞質中發揮抗凋亡效應；另一方面，p-Bad與bcl-2解聚，而游離的bcl-2發揮抗凋亡作用〔10〕。

Survivin是抗凋亡蛋白家族(IAP)中最小的一個抗凋亡基因，在正常組織(子宮內膜等少數組織除外)不表達，而在多種腫瘤組織中呈周期依賴性的表達〔11〕。

Survivin通過抑制細胞色素C從線粒體的釋放從而在上游就阻斷了凋亡信號的傳導；Survivin能夠阻止Caspase-9前體構象的改變，進而阻止下游Caspases分子前體蛋白的分解，且Survivin可與Caspase-3和Caspase-7結合并抑制其活性，進而抑制細胞凋亡〔12〕。本研究結果提示TMP誘導HeLa細胞凋亡、抑制其增殖，與其降低抗凋亡蛋白p-Bad和Survivin表達有關。

4參考文獻

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11謝平，阮秋蓉，李軍川.Survivin，Bcl-2在乳腺癌中的表達及意義〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2004；13(2)：147-50.

12謝海洋，劉邕波.Caspase-3及Survivin與心肌細胞凋亡的研究進展〔J〕.臨床醫學工程，2014；21(1)：124-5.

〔2015-10-25修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

基金項目：黑龍江省自然科學基金資助項目(H2015074)；黑龍江省衛生廳科研項目(2009-336)；黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目(1252G059)；佳木斯大學科技重點項目(Sz2011-009)；佳木斯大學大學生創新創業訓練計劃項目(201510222026)

通訊作者：柳朝陽(1971-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事腫瘤干細胞和神經內分泌免疫研究。

〔中圖分類號〕R285.5;R73-36

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2605-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.016

1佳木斯大學醫政管理處2佳木斯大學附屬第一醫院

3佳木斯大學2014級免疫學碩士

第一作者：張濤(1971-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中草藥抗腫瘤及腫瘤免疫機制方面的研究。