血小板內皮細胞黏附分子1在肺癌中表達及與轉移的關系

繆小輝　夏錫儀　呂鏜烽　宋　勇　莊志方

(江蘇大學附屬醫院 常州市武進人民醫院呼吸內科,江蘇　常州　213000)

血小板內皮細胞黏附分子1在肺癌中表達及與轉移的關系

繆小輝夏錫儀呂鏜烽1宋勇1莊志方

(江蘇大學附屬醫院 常州市武進人民醫院呼吸內科,江蘇常州213000)

〔摘要〕目的探討血小板內皮細胞黏附分子(PECAM)1在非小細胞肺癌(NSCLC)中表達及其與轉移的關系。方法建立穩轉PECAM1的A549細胞，加入抗PECAM1抗體抑制后，觀察A549細胞生長。通過免疫組化方法檢測105例NSCLC及10例肺良性病變的組織切片中PECAM1蛋白水平，分析PECAM1與患者肺癌的轉移及愈后關系。結果加入抗PECAM1抗體，A549擴增抑制明顯。NSCLC組織中，PECAM1表達陽性率明顯高于肺良性病變組織(χ2=8.980，P=0.003)。PECAM1表達與肺癌患者淋巴結轉移存在顯著相關性(P=0.023)。PECAM1表達與患者無疾病生存期(PFS)及總生存期(OS)存在一定相關性(P=0.002，0.016)。結論在非小細胞肺癌中，PECAM1是患者肺癌轉移及不良預后的生物學標志。

〔關鍵詞〕血小板內皮細胞黏附分子1;肺癌;轉移;預后

肺癌的局部侵襲、淋巴結轉移和遠處轉移是導致患者死亡的主要原因。腫瘤的轉移機制仍未完全明確。血小板內皮細胞黏附分子(PECAM)1參與調節腫瘤的生長、轉移及新生血管形成。在肺癌的轉移機制中，是否通過VE-鈣黏蛋白(VE-cadherin)和血小板內皮細胞黏附分子(PECAM)組成信號復合物而激活內皮細胞的整合素，本研究通過臨床標本檢測，明確PECAM1在非小細胞肺癌(NSCLC)轉移中的作用。

1材料與方法

1.1標本腫瘤組織切片由常州市武進人民醫院呼吸內科以及南京軍區南京總醫院呼吸內科提供，2006年1月至2014年1月收集的腫瘤組105例原發性NSCLC的腫瘤組織為實驗組及10例對照組良性病變肺組織(肺結核1例、炎性假瘤1例、肺大皰3例、支氣管擴張5例)的手術標本，手術前期均未經化學治療及放射治療。腫瘤組織學分期(TNM分期)基于國際癌癥聯盟(UICC)2009版分類法分期。其中實驗組包括60例腺癌和45例鱗癌。本研究得到常州市醫學倫理委員會批準。

1.2方法采用A549細胞株(ATCC細胞庫提供CCL-185)。構建穩定表達PECAM1的肺癌細胞株。加入抗人PECAM1單克隆抗體(E0458 Santa Cruz公司)，觀察A549細胞株生長狀況。采用常用免疫組織化學染色(Envision)的方法，組織切片經常規程序給予脫蠟和復水。兔抗人PECAM1單克隆抗體(E0458 Santa Cruz公司)首先經抗體稀釋液磷酸鹽緩沖液(PBS)按1∶100稀釋，加入組織切片中，孵化過夜。經PBS液沖洗后，加入山羊抗兔二抗體(丹麥Dako公司)，繼續孵育30 min。再次經PBS液沖洗后，組織切片經雙色顯示劑(DAB顯色劑)孵化30 min。經蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片。按評分系統(Remmele)，選取5個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞。計算PECAM1細胞質染色的程度(陽性細胞呈棕黃色)。按陽性細胞百分比<5%為(-)，5%～25%為(+)，25%～50%為()，≥50%為()。<25%(-～+)為低表達組，≥25%(～)為高表達組。

1.3統計學分析實驗組從接受手術日期開始隨訪，至患者死亡日期結束隨訪，2015年6月1日仍然生存或無疾病進展生存的按60個月計算(生存者隨訪<60個月不納入實驗組)。采用SPSS19.0軟件行χ2檢驗及Kaplan-Meire生存分析。

2結果

2.1穩轉PECAM1的A549細胞生長狀況構建穩定表達PECAM1的A549細胞，A549細胞擴增明顯。在加入抗PECAM1抗體后，A549細胞擴增明顯抑制。見圖1。

2.2兩組PECAM1的表達根據免疫組化染色顯示，PECAM1定位于組織細胞的細胞膜中，表達程度如PECAM1陰性表達的肺良性病變組織(圖2A)，低表達組肺腺癌(+，圖2B)及肺鱗狀細胞癌PECAM1高表達組(，圖2C)。

實驗組中PECAM1表達陽性68例(64.76%)，對照組僅為1例(10.00%)，兩組差異顯著(χ2=8.980，P=0.003)。

2.3PECAM1在NSCLC組織中的表達及其與臨床特征的關系PECAM1表達與臨床特征無明顯相關性(P>0.05)，見表1。

2.4PECAM1表達與NSCLC患者的無疾病進展生存期(PFS)及總生存期(OS)關系至隨訪結束時，肺癌患者的生存人數為31例(29.52%)。無肺癌疾病進展生存人數為19例。腫瘤組織中PECAM1陽性表達與患者的PFS及OS存在相關(χ2=19.795，P=0.001；χ2=10.318，P=0.016)，見表2。整體肺癌術后患者的PFS中位時間為18個月(95%CI11.127～24.513)，OS中位時間為33個月(95%CI22.136～49.535)。PECAM1表達陰性組中，PFS中位時間為33個月(95%CI13.428～53.572)，OS中位時間為43個月(95%CI39.275～52.049)；PECAM1表達陽性組中，PFS中位時間為11個月(95%CI9.634～14.328)，OS中位時間為27個月(95%CI17.316～28.094)。PECAM1陰性組的PFS和OS中位時間明顯長于陽性組。PECAM1表達陽性組PFS顯著低于陰性組(χ2=19.795，P=0.001圖3)，同樣兩組的OS存在顯著差異(χ2=10.318，P=0.016 圖3)，PECAM1陽性組預后明顯差于陰性組。

A：A549細胞株;B：穩轉PECAM1的A549細胞;C：抗PECAM1抗體抑制后的A549細胞圖1　穩轉PECAM1的A549細胞

A：PECAM1在肺良性病變(肺大皰)組織中陰性表達;B：PECAM1在肺腺癌組織中低表達;C：PECAM1在肺鱗狀細胞癌組織中高表達圖2　PECAM1在NSCLC以及良性病變組織中的表達

圖3　PECAM1與NSCLC患者預后相關的Kaplan-Meier生存曲線

指標nPECAM1陽性表達χ2值P值性別 男6643(65.15)0.0120.913 女3925(64.10)年齡(歲) <604525(55.56)2.9250.087 ≥606043(71.67)吸煙4935(71.43)腫瘤大小(cm) ≤33119(61.29)0.0000.992 >37449(66.22)組織形態 鱗癌4526(57.78)0.2320.630 腺癌6042(70.00)N分期 N06134(55.74)5.1950.023 N1～34434(77.27)TNM分期 Ⅰ+Ⅱ7549(65.33)0.0380.846 Ⅲ+Ⅳ3019(63.33)分級 高/中分化5836(62.07)0.4120.521 低分化4732(68.09)

表2　PECAM1與患者PFS及OS的關系〔n(%)〕

3討論

肺癌發病機制復雜，但目前認為，吸煙和空氣污染是肺癌發生的主要社會環境因素，戒煙和改善生存環境是降低肺癌發生的主要手段。遠處轉移是導致肺癌患者死亡的重要原因，依據目前診斷和治療方法，肺癌早期診斷率低，病死率高。轉移是導致腫瘤患者治療失敗的主要原因。腫瘤轉移是一個多步驟的過程，它包括了腫瘤細胞的遷移、侵襲并穿過腫瘤基質，通過內滲或外滲穿過血管以及最終在遠處某器官的積聚〔1〕。腫瘤細胞的侵襲能力是導致腫瘤遠處轉移的首要因素。腫瘤細胞與細胞外基質之間的相互作用影響著腫瘤的轉移，腫瘤轉移能夠成功的一個關鍵是腫瘤新生血管的形成〔2〕。

PECAM1又稱CD31，分子量約130 kD，是一種細胞膜表面蛋白。正常表達于白細胞、血小板和血管內皮細胞〔3〕。PECAM1參與細胞生長和腫瘤細胞增殖及擴散，其中包括血管的生成、血管滲透和血液循環外的白細胞募集〔4〕。近年來研究發現，PECAM1在多種腫瘤的轉移中起著重要作用〔5〕。PECAM1在腫瘤侵襲中的作用逐漸被研究者重視。PECAM1被認為與腫瘤進展有關，作為細胞外基質蛋白參與細胞黏附及遷移的調控及促進腫瘤的新生血管生成。

在多種腫瘤組織中，如胰島管腺癌，肝癌等，發現PECAM1過表達〔6,7〕。卵巢癌研究中動物實驗證實PECAM1可促進腫瘤細胞的侵襲、轉移和存活能力〔8,9〕，故認為PECAM1水平可能與腫瘤的惡性程度成正相關。現今，PECAM1作為一個可能的腫瘤治療的靶點及惡性度預測因子已越來越為腫瘤研究者矚目。PECAM1調節腫瘤的生長、轉移及新生血管形成的作用機制到目前為止只有初步探索。筆者構建穩定表達PECAM1的A549細胞，A549細胞擴增明顯。在加入抗PECAM1抗體后，A549細胞擴增明顯抑制。PECAM1調節腫瘤細胞生長。整合素主要參與構成細胞外基質-整合素-細胞骨架跨膜復合體，可誘導細胞骨架重排，增強細胞間的機械聯系，雙向轉導細胞內外的信號，廣泛影響細胞的增殖、侵襲和轉移等生物學行為。PECAM1通過參與整合素調控腫瘤細胞轉移及侵襲〔10,11〕，目前機制未明確。本研究證實PECAM1可促進腫瘤細胞淋巴結的轉移，PECAM1表達陽性患者發生淋巴結轉移可能。另外，PECAM1促進腫瘤細胞的侵襲能力，促使肺癌細胞的轉移，最終影響患者的生存期。

4參考文獻

1Liu GQ，Aaron TP，Chen ZL，etal.ICAM-1-activated Src and eNOS signaling increase endothelial cell surface PECAM-1 adhesivity and neutrophil transmigration〔J〕.Blood,2012；120(9)：1942-52.

2Horace DeL，Liu Y，Pierre-Yves De，etal.Vascular endothelial platelet endothelial cell adhesion molecule 1(PECAM-1)regulates advanced metastatic progression〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2010；107(43)：18616-21.

3Ma L，Kenneth CP.CD31 exhibits multiple roles in regulating T lymphocyte trafficking in vivo〔J〕.J Immunol,2012；189(8)：4104-11.

4Jamie RP.Relative contribution of PECAM-1 adhesion and signaling to the maintenance of vascular integrity〔J〕.J Cell Sci,2011；124(9)：1477-85.

5Ann-Marie C，Madhura N，Colin F，etal.Collaborative enhancement of antibody binding to distinct PECAM-1 epitopes modulates endothelial targeting〔J〕.J Cell Biol PLoS One,2012；7(4)：e34958.

6Yao S，Zhang J，Chen H，etal.Diagnostic value of immunohistochemical staining of GP73，GPC3，DCP，CD34，CD31，and reticulin staining in hepatocellular carcinoma〔J〕.J Histochem Cytochem,2013；61(9)：639-48.

7Kuang BH，Wen XZ，Ding Y，etal.The prognostic value of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 in non-small-cell lung cancer patients〔J〕.Med Oncol,2013；30(2)：536.

8Tachezy M，Reichelt U，Melenberg T，etal.Angiogenesis index CD105(endoglin)/CD31(PECAM-1)as a predictive factor for invasion and proliferation in intraductal papillary mucinous neoplasm(IPMN)of the pancreas〔J〕.Histol Histopathol,2010；25(10)：1239-46.

9Kim OH，Kang GH，Noh H，etal.Proangiogenic TIE2(+)/CD31(+)macrophages are the predominant population of tumor-associated macrophages infiltrating metastatic lymph nodes〔J〕.Mol Cells,2013；36(5)：432-8.

10Eleni T，Mohamed Irani-T，William B，etal.A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress〔J〕.Nature,2005；437(7057):426-31.

11Desgrosellier JS，Cheresh DA.Integrins in cancer：biological implications and therapeutic opportunities〔J〕.Nat Rev Cancer,2010；10(1)：9-22.

〔2016-01-10修回〕

(編輯曲莉)

基金項目：江蘇大學臨床醫學科技發展基金(JLY20120033)資助

通訊作者：莊志方(1967-)，男，副主任醫師，主要從事肺部疾病的診治研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2411-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.045

1南京大學醫學院臨床學院南京軍區南京總醫院呼吸內科

第一作者：繆小輝(1971-)，男，副主任醫師，碩士，主要從事呼吸及戒煙-慢阻肺方面的研究。