10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物和趨化因子配體18在老年三陰及非三陰乳腺癌中的表達(dá)差異及意義

盧家希　胥　尹　姜　昕　陳曉品

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，重慶　400016)

10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物和趨化因子配體18在老年三陰及非三陰乳腺癌中的表達(dá)差異及意義

盧家希胥尹1姜昕2陳曉品

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，重慶400016)

〔摘要〕目的探討10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)和趨化因子配體(CCL)18在老年三陰乳腺癌(TNBC)及非三陰乳腺癌(NTNBC)中的表達(dá)差異及其可能的臨床意義。方法采用SP免疫組化法分別檢測PTEN和CCL18在25例NTNBC、25例TNBC(兩組均未行新輔助化療，術(shù)后病理分期相近)及15例良性乳腺增生病(BBD)中的表達(dá)情況。結(jié)果PTEN、CCL18均在胞膜、胞質(zhì)表達(dá)。PTEN在NTNBC組、TNBC組陽性表達(dá)率分別為92%和68%，差異顯著(P=0.011)，而在BBD組中PTEN陽性率達(dá)到了100%；CCL18在NTNBC組中陽性率為88%，在TNBC組中為100%，差異不顯著(P=0.247)，CCL18在BBD組中則無表達(dá)。NTNBC組CCL18陽性表達(dá)主要位于癌巢區(qū)域，癌間質(zhì)較少，TNBC組則主要表現(xiàn)為癌巢及癌間質(zhì)區(qū)域的廣泛強(qiáng)陽性。各組陽性切片積分光密度值(IOD)分析提示TNBC組PTEN表達(dá)水平較NTNBC組有明顯下調(diào)(P<0.01)，而CCL18則為高表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論老年三陰乳腺癌較非三陰乳腺癌有顯著的PTEN表達(dá)下調(diào)或缺失，同時伴隨CCL18廣泛高表達(dá)，這可能是導(dǎo)致其較非三陰型易發(fā)生化療耐藥及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原因之一。

〔關(guān)鍵詞〕三陰乳腺癌；非三陰乳腺癌；10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)；趨化因子配體(CCL)18

我國乳腺癌總體死亡率雖明顯下降，但近十余年來其在中老年婦女中發(fā)病及死亡的絕對人數(shù)反而呈上升趨勢〔1，2〕。三陰乳腺癌(TNBC)被認(rèn)為是乳腺癌中一類獨(dú)立的病理類型，其雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體(HER)-2均為陰性。據(jù)統(tǒng)計，TNBC在我國乳腺癌中的比例約為22%，高于歐美國家的15.4%～19.9%。TNBC侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差，內(nèi)分泌及靶向治療無效，其化療總有效率雖并不比非三陰乳腺癌(NTNBC)低，但阿霉素聯(lián)合環(huán)磷酰胺或蒽環(huán)類聯(lián)合紫杉醇的經(jīng)典方案使其獲得臨床完全緩解(CCR)的概率卻明顯偏低，生存率也未能提高。此外，TNBC與NTNBC相比術(shù)后局部復(fù)發(fā)率并無顯著差異，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險明顯增高。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化檢測人10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)和趨化因子配體(CCL)18在TNBC及NTNBC中的表達(dá)情況，以期發(fā)現(xiàn)更多與TNBC相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)。

1資料與方法

1.1一般資料重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及重慶市中山醫(yī)院2007年1月至2010年6月有完整病理資料、行改良根治術(shù)切除且術(shù)前未行新輔助化療的浸潤性乳腺癌患者。均要求術(shù)前檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后病理證實(shí)腫瘤最大直徑≤5 cm、無胸壁、皮膚侵犯、腋窩陽性淋巴結(jié)數(shù)為1～9個〔即美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)乳腺癌TNM分期為pT1-2N1-2M0〕。分組標(biāo)準(zhǔn)：NTNBC組25例，TNBC組25例，全部病例經(jīng)術(shù)后免疫組化檢測及病理科再次復(fù)閱，保證TNBC組ER、PR、HER-2均為陰性，NTNBC組則滿足ER陽性，PR、HER-2至少1項(xiàng)陽性。NTNBC組發(fā)病年齡60～76歲，中位年齡65歲，腫瘤直徑1.5～4.5 cm，腋窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)1～8個；TNBC組發(fā)病年齡61～74歲，中位年齡65歲，腫瘤直徑2.8～4.8 cm，腋窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)2～9個；另選擇經(jīng)病理證實(shí)的乳腺良性增生(BBD)15例。主要試劑包括：兔抗人PTEN多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、兔抗人CCL-18多克隆抗體(Abcam公司)。生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，SP免疫組化試劑盒和濃縮型DAB試劑均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2PTEN和CCL18表達(dá)的檢測采用SP免疫組化法，取各組各病例石蠟包埋組織切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)后，過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性15 min，山羊血清阻斷非特異性反應(yīng)15 min，分別滴加兔抗人PTEN抗體(1∶150稀釋)或兔抗人CCL18抗體(1∶30稀釋)，室溫作用1 h，4℃過夜；37℃復(fù)溫1 h，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，作用40 min；加入鏈霉抗生素-過氧化物酶溶液作用40 min，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精輕度對比染色后脫水、透明并用中性樹膠封片。各組中每病例選取2張切片(每組共40～50張)，由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生分別在高倍視野(×400)下觀察，盡量排除非特異性染色區(qū)域，選取效果最好的視野攝像用于圖像分析。采用染色強(qiáng)度和分布雙評分半定量法評估表達(dá)情況，染色強(qiáng)度打分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色或棕褐色2分；分布區(qū)域評分：無陽性細(xì)胞0分，陽性細(xì)胞<10%為1分，11%～49%為2分，陽性比例≥50%為3分。當(dāng)染色強(qiáng)度與分布兩項(xiàng)評分相加≥2時，視為有陽性表達(dá)，否則為陰性，3～4分為中等強(qiáng)度表達(dá)，5分及以上為強(qiáng)陽性表達(dá)。計算各組有陽性表達(dá)切片的積分光密度值(IOD)，作為評估表達(dá)強(qiáng)度差異的半定量指標(biāo)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1PTEN、CCL18在BBD組的表達(dá)PTEN的陽性表達(dá)率為100%(15/15)。在乳腺增生的導(dǎo)管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見廣泛的PTEN表達(dá)，且多數(shù)病例為強(qiáng)陽性表達(dá)，而CCL18在BBD組中均未見有表達(dá)。見圖1。

圖1　PTEN、CCL18在BBD組表達(dá)情況(×200)

2.2PTEN在NTNBC組、TNBC組的表達(dá)情況PTEN在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)定位于胞膜和胞質(zhì)，根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度呈淡黃色、棕黃色至棕褐色，胞核無表達(dá)呈藍(lán)紫色。見圖2。在NTNBC組PTEN總陽性率為92%(23/25)，TNBC組則為68%(17/25)，兩組陽性率差異顯著(χ2=6.424，P=0.011)。IOD分析比較BBD組PTEN平均表達(dá)水平(23 850±4 283)最高，NTNBC組較之有明顯下調(diào)(12 470±2 133)，而TNBC組水平最低(3 987±1 467)。三組間兩兩比較，差異顯著(P<0.01)。

2.3CCL18在NTNBC組、TNBC組的表達(dá)情況CCL18陽性表達(dá)定位于胞質(zhì)或胞膜，呈棕黃色至黃褐色顆粒狀，細(xì)胞核無染色呈藍(lán)紫色。CCL18在NTNBC組中的陽性率為88%(22/25)，而在TNBC組為100%，即全部病例均可見陽性表達(dá)。兩組陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.247)。在NTNBC組中病例中陽性表達(dá)主要位于癌巢區(qū)域，間質(zhì)無浸潤，TNBC組則可見癌巢及癌間質(zhì)區(qū)域的廣泛強(qiáng)陽性表達(dá)。見圖3。兩組陽性病例切片IOD分析示，TNBC組CCL18的總體表達(dá)水平(33 862±7 128)較NTNBC組(17 923±5 477)有明顯上調(diào)(P<0.01)。

NTNBC組：①PTEN多為強(qiáng)陽性，②少數(shù)PTEN為弱陽性；TNBC組：③PTEN多為弱陽性，④8例出現(xiàn)PTEN表達(dá)缺失圖2　NTNBC組及TNBC組中PTEN的表達(dá)(×200)

NTNBC組：①多為癌巢內(nèi)散在表達(dá)，②少數(shù)在癌巢內(nèi)強(qiáng)陽性，但間質(zhì)無明顯浸潤；TNBC組：③癌巢內(nèi)多為強(qiáng)陽性表達(dá)，④多伴有間質(zhì)的廣泛浸潤圖3　NTNBC組及TNBC組中CCL18的表達(dá)(×200)

3討論

PTEN是第一個被發(fā)現(xiàn)具有磷酸酶功能的抑癌基因，不僅抑制腫瘤細(xì)胞生長，而且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡〔3〕。老年TNBC組織中存在PTEN的表達(dá)缺失，其能夠增強(qiáng)TNBC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、加強(qiáng)侵襲性及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔4〕。乳腺良性增生組織中，作為抑癌蛋白的PTEN一般不存在表達(dá)缺失情況，而由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)分泌的CCL18無表達(dá)。本研究說明無論TNBC還是NTNBC中均存在著PTEN蛋白的缺失；并且TNBC中PTEN的表達(dá)明顯低于NTNBC，提示PTEN蛋白表達(dá)在TNBC組織中較NTNBC進(jìn)一步減弱，可能是由于抑癌基因PTEN出現(xiàn)了更多缺失和突變的結(jié)果，和國內(nèi)一些研究保持一致〔5〕。PTEN蛋白的表達(dá)率隨著組織學(xué)分級的增高而降低，并且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的PTEN蛋白表達(dá)率明顯高于有淋巴轉(zhuǎn)移組陽性率〔6〕。方茅等〔7〕發(fā)現(xiàn)，PTEN在TNBC組織中的表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化和TNM分期密切相關(guān)，表明PTEN的表達(dá)水平越低，腫瘤惡性程度越高。本研究結(jié)果說明TNBC惡性程度高于NTNBC。CCL18是由巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞分泌產(chǎn)生的炎癥趨化因子，具有維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡，促進(jìn)血管生長，白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等功能，在腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要〔8〕，其過度表達(dá)能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲能力。胡祖健等〔9〕對比乳腺癌組織、癌周組織和良性乳房組織發(fā)現(xiàn)，CCL18在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其他兩組。推測CCL18高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。陳靜琦等〔10〕研究表明CCL18可通過引起乳腺癌細(xì)胞表面整合素的聚集，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)的數(shù)量明顯增多，而黏附在乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用。從而得出CCL18能促進(jìn)乳腺癌浸潤、遷移。TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，疾病更難控制。

鑒于PTEN與BRCA1的密切關(guān)系及其在乳腺癌化療耐藥中的作用機(jī)制，在TNBC患者治療前，同時檢測PTEN及BRCA1的表達(dá)情況對其化療方案的選擇及預(yù)后判斷可能會有所幫助。TNBC中CCL18在表達(dá)范圍及強(qiáng)度上均較NTNBC顯著擴(kuò)大、上調(diào)，提示針對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)及阻斷CCL18受體通路的治療有可能成為降低乳腺癌尤其是TNBC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險，提高生存率的重要方法。

綜上，PTEN基因的失活、CCL18基因的上調(diào)與TNBC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此臨床上聯(lián)合檢測二者可能為TNBC預(yù)后評估、患者的個體化治療提供一定的參考，為TNBC在基因水平上的診斷與治療提供新的思路。

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10陳靜琦，朱必勝，侯開連.CCL18 通過促進(jìn)整合素的聚集增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)〔J〕.中國癌癥雜志，2013；23(1)：26-31.

〔2014-12-19修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：陳曉品(1964-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，主要從事惡性腫瘤研究。

〔中圖分類號〕R737.9

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2354-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.018

1廈門市第二醫(yī)院放療科2重慶市中山醫(yī)院病理科

第一作者：盧家希(1977-),男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事乳腺癌研究。