10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物和趨化因子配體18在老年三陰及非三陰乳腺癌中的表達差異及意義

盧家希　胥　尹　姜　昕　陳曉品

(重慶醫科大學附屬第一醫院腫瘤科，重慶　400016)

10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物和趨化因子配體18在老年三陰及非三陰乳腺癌中的表達差異及意義

盧家希胥尹1姜昕2陳曉品

(重慶醫科大學附屬第一醫院腫瘤科，重慶400016)

〔摘要〕目的探討10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)和趨化因子配體(CCL)18在老年三陰乳腺癌(TNBC)及非三陰乳腺癌(NTNBC)中的表達差異及其可能的臨床意義。方法采用SP免疫組化法分別檢測PTEN和CCL18在25例NTNBC、25例TNBC(兩組均未行新輔助化療，術后病理分期相近)及15例良性乳腺增生病(BBD)中的表達情況。結果PTEN、CCL18均在胞膜、胞質表達。PTEN在NTNBC組、TNBC組陽性表達率分別為92%和68%，差異顯著(P=0.011)，而在BBD組中PTEN陽性率達到了100%；CCL18在NTNBC組中陽性率為88%，在TNBC組中為100%，差異不顯著(P=0.247)，CCL18在BBD組中則無表達。NTNBC組CCL18陽性表達主要位于癌巢區域，癌間質較少，TNBC組則主要表現為癌巢及癌間質區域的廣泛強陽性。各組陽性切片積分光密度值(IOD)分析提示TNBC組PTEN表達水平較NTNBC組有明顯下調(P<0.01)，而CCL18則為高表達(P<0.01)。結論老年三陰乳腺癌較非三陰乳腺癌有顯著的PTEN表達下調或缺失，同時伴隨CCL18廣泛高表達，這可能是導致其較非三陰型易發生化療耐藥及遠處轉移的原因之一。

〔關鍵詞〕三陰乳腺癌；非三陰乳腺癌；10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)；趨化因子配體(CCL)18

我國乳腺癌總體死亡率雖明顯下降，但近十余年來其在中老年婦女中發病及死亡的絕對人數反而呈上升趨勢〔1，2〕。三陰乳腺癌(TNBC)被認為是乳腺癌中一類獨立的病理類型，其雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體(HER)-2均為陰性。據統計，TNBC在我國乳腺癌中的比例約為22%，高于歐美國家的15.4%～19.9%。TNBC侵襲性強、預后差，內分泌及靶向治療無效，其化療總有效率雖并不比非三陰乳腺癌(NTNBC)低，但阿霉素聯合環磷酰胺或蒽環類聯合紫杉醇的經典方案使其獲得臨床完全緩解(CCR)的概率卻明顯偏低，生存率也未能提高。此外，TNBC與NTNBC相比術后局部復發率并無顯著差異，但遠處轉移風險明顯增高。本實驗應用免疫組化檢測人10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)和趨化因子配體(CCL)18在TNBC及NTNBC中的表達情況，以期發現更多與TNBC相關的生物學指標。

1資料與方法

1.1一般資料重慶醫科大學附屬第一醫院及重慶市中山醫院2007年1月至2010年6月有完整病理資料、行改良根治術切除且術前未行新輔助化療的浸潤性乳腺癌患者。均要求術前檢查未發現遠處轉移、術后病理證實腫瘤最大直徑≤5 cm、無胸壁、皮膚侵犯、腋窩陽性淋巴結數為1～9個〔即美國癌癥聯合委員會(AJCC)乳腺癌TNM分期為pT1-2N1-2M0〕。分組標準：NTNBC組25例，TNBC組25例，全部病例經術后免疫組化檢測及病理科再次復閱，保證TNBC組ER、PR、HER-2均為陰性，NTNBC組則滿足ER陽性，PR、HER-2至少1項陽性。NTNBC組發病年齡60～76歲，中位年齡65歲，腫瘤直徑1.5～4.5 cm，腋窩轉移淋巴結1～8個；TNBC組發病年齡61～74歲，中位年齡65歲，腫瘤直徑2.8～4.8 cm，腋窩轉移淋巴結2～9個；另選擇經病理證實的乳腺良性增生(BBD)15例。主要試劑包括：兔抗人PTEN多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)、兔抗人CCL-18多克隆抗體(Abcam公司)。生物素標記的山羊抗兔IgG，SP免疫組化試劑盒和濃縮型DAB試劑均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

1.2PTEN和CCL18表達的檢測采用SP免疫組化法，取各組各病例石蠟包埋組織切片，經脫蠟、抗原修復后，過氧化物酶阻斷內源性過氧化物酶活性15 min，山羊血清阻斷非特異性反應15 min，分別滴加兔抗人PTEN抗體(1∶150稀釋)或兔抗人CCL18抗體(1∶30稀釋)，室溫作用1 h，4℃過夜；37℃復溫1 h，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG，作用40 min；加入鏈霉抗生素-過氧化物酶溶液作用40 min，經二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精輕度對比染色后脫水、透明并用中性樹膠封片。各組中每病例選取2張切片(每組共40～50張)，由2位經驗豐富的病理科醫生分別在高倍視野(×400)下觀察，盡量排除非特異性染色區域，選取效果最好的視野攝像用于圖像分析。采用染色強度和分布雙評分半定量法評估表達情況，染色強度打分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色或棕褐色2分；分布區域評分：無陽性細胞0分，陽性細胞<10%為1分，11%～49%為2分，陽性比例≥50%為3分。當染色強度與分布兩項評分相加≥2時，視為有陽性表達，否則為陰性，3～4分為中等強度表達，5分及以上為強陽性表達。計算各組有陽性表達切片的積分光密度值(IOD)，作為評估表達強度差異的半定量指標。

1.3統計學方法采用SPSS19.0統計軟件進行χ2、t檢驗。

2結果

2.1PTEN、CCL18在BBD組的表達PTEN的陽性表達率為100%(15/15)。在乳腺增生的導管上皮細胞胞質內可見廣泛的PTEN表達，且多數病例為強陽性表達，而CCL18在BBD組中均未見有表達。見圖1。

圖1　PTEN、CCL18在BBD組表達情況(×200)

2.2PTEN在NTNBC組、TNBC組的表達情況PTEN在乳腺癌組織中的陽性表達定位于胞膜和胞質，根據表達強度呈淡黃色、棕黃色至棕褐色，胞核無表達呈藍紫色。見圖2。在NTNBC組PTEN總陽性率為92%(23/25)，TNBC組則為68%(17/25)，兩組陽性率差異顯著(χ2=6.424，P=0.011)。IOD分析比較BBD組PTEN平均表達水平(23 850±4 283)最高，NTNBC組較之有明顯下調(12 470±2 133)，而TNBC組水平最低(3 987±1 467)。三組間兩兩比較，差異顯著(P<0.01)。

2.3CCL18在NTNBC組、TNBC組的表達情況CCL18陽性表達定位于胞質或胞膜，呈棕黃色至黃褐色顆粒狀，細胞核無染色呈藍紫色。CCL18在NTNBC組中的陽性率為88%(22/25)，而在TNBC組為100%，即全部病例均可見陽性表達。兩組陽性率差異無統計學意義(P=0.247)。在NTNBC組中病例中陽性表達主要位于癌巢區域，間質無浸潤，TNBC組則可見癌巢及癌間質區域的廣泛強陽性表達。見圖3。兩組陽性病例切片IOD分析示，TNBC組CCL18的總體表達水平(33 862±7 128)較NTNBC組(17 923±5 477)有明顯上調(P<0.01)。

NTNBC組：①PTEN多為強陽性，②少數PTEN為弱陽性；TNBC組：③PTEN多為弱陽性，④8例出現PTEN表達缺失圖2　NTNBC組及TNBC組中PTEN的表達(×200)

NTNBC組：①多為癌巢內散在表達，②少數在癌巢內強陽性，但間質無明顯浸潤；TNBC組：③癌巢內多為強陽性表達，④多伴有間質的廣泛浸潤圖3　NTNBC組及TNBC組中CCL18的表達(×200)

3討論

PTEN是第一個被發現具有磷酸酶功能的抑癌基因，不僅抑制腫瘤細胞生長，而且促進腫瘤細胞凋亡〔3〕。老年TNBC組織中存在PTEN的表達缺失，其能夠增強TNBC患者的淋巴結轉移、加強侵襲性及遠處轉移〔4〕。乳腺良性增生組織中，作為抑癌蛋白的PTEN一般不存在表達缺失情況，而由腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)分泌的CCL18無表達。本研究說明無論TNBC還是NTNBC中均存在著PTEN蛋白的缺失；并且TNBC中PTEN的表達明顯低于NTNBC，提示PTEN蛋白表達在TNBC組織中較NTNBC進一步減弱，可能是由于抑癌基因PTEN出現了更多缺失和突變的結果，和國內一些研究保持一致〔5〕。PTEN蛋白的表達率隨著組織學分級的增高而降低，并且無淋巴結轉移組的PTEN蛋白表達率明顯高于有淋巴轉移組陽性率〔6〕。方茅等〔7〕發現，PTEN在TNBC組織中的表達與腋窩淋巴結轉移、組織學分化和TNM分期密切相關，表明PTEN的表達水平越低，腫瘤惡性程度越高。本研究結果說明TNBC惡性程度高于NTNBC。CCL18是由巨噬細胞和樹突細胞分泌產生的炎癥趨化因子，具有維持機體內環境平衡，促進血管生長，白細胞轉運等功能，在腫瘤的形成與轉移過程中起著非常重要〔8〕，其過度表達能夠增強癌細胞的侵襲能力。胡祖健等〔9〕對比乳腺癌組織、癌周組織和良性乳房組織發現，CCL18在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于其他兩組。推測CCL18高表達與乳腺癌的發生發展密切相關。陳靜琦等〔10〕研究表明CCL18可通過引起乳腺癌細胞表面整合素的聚集，導致乳腺癌細胞黏附于細胞外基質的數量明顯增多，而黏附在乳腺癌的浸潤和轉移過程中起關鍵作用。從而得出CCL18能促進乳腺癌浸潤、遷移。TNBC細胞的轉移能力更強，疾病更難控制。

鑒于PTEN與BRCA1的密切關系及其在乳腺癌化療耐藥中的作用機制，在TNBC患者治療前，同時檢測PTEN及BRCA1的表達情況對其化療方案的選擇及預后判斷可能會有所幫助。TNBC中CCL18在表達范圍及強度上均較NTNBC顯著擴大、上調，提示針對腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)及阻斷CCL18受體通路的治療有可能成為降低乳腺癌尤其是TNBC遠處轉移風險，提高生存率的重要方法。

綜上，PTEN基因的失活、CCL18基因的上調與TNBC的發生發展密切相關，因此臨床上聯合檢測二者可能為TNBC預后評估、患者的個體化治療提供一定的參考，為TNBC在基因水平上的診斷與治療提供新的思路。

4參考文獻

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5孟翠麗，郭睿，齊鳳杰，等.PTEN，p53 和 BAG-1 在三陰乳腺癌中的表達及意義〔J〕.醫學與哲學(臨床決策論壇版)，2014；35(10)：71-3.

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7方茅，翁澤平，關弘，等.三陰性乳腺癌組織 DJ-1 和 PTEN 及 AR 表達與預后相關性分析〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2013；20(10)：761-4.

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9胡祖健，徐海濱，任興昌，等.CCL18，MVD 在乳腺癌組織中的表達及其與患者預后的關系研究〔J〕.中國現代醫生，2013；51(36)：20-2.

10陳靜琦，朱必勝，侯開連.CCL18 通過促進整合素的聚集增強乳腺癌細胞黏附于細胞外基質〔J〕.中國癌癥雜志，2013；23(1)：26-31.

〔2014-12-19修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：陳曉品(1964-)，男，博士，主任醫師，教授，主要從事惡性腫瘤研究。

〔中圖分類號〕R737.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2354-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.018

1廈門市第二醫院放療科2重慶市中山醫院病理科

第一作者：盧家希(1977-),男，主治醫師，碩士，主要從事乳腺癌研究。