秦皮素對腦缺血再灌注損傷小鼠的保護作用

陳美華　張　燕　陳　偉　馬　健

(泰山醫學院藥學院，山東　泰安　271016)

秦皮素對腦缺血再灌注損傷小鼠的保護作用

陳美華張燕陳偉馬健

(泰山醫學院藥學院，山東泰安271016)

〔摘要〕目的觀察秦皮素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制。 方法采用反復夾閉雙側頸總動脈制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型，秦皮素高、中、低3個劑量于造模前分別腹腔注射給藥，術后24 h及48 h,用跳臺法分別測定小鼠的學習記憶能力，測定腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)含量及髓過氧化物酶(MPO)活性，并測定Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性，HE染色觀察腦組織的病理形態學變化。結果模型組小鼠的學習記憶能力降低，秦皮素各劑量組小鼠的學習記憶能力明顯提高(P<0.05)。秦皮素高、中、低劑量組可提高腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性，降低MDA含量和MPO活性，與模型組差異顯著(P<0.05)。秦皮素各劑量組可明顯提高腦組織Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性(P<0.05)。結論秦皮素對腦缺血再灌注損傷小鼠有保護作用，其機制與抗氧化、抑制炎癥反應及改善細胞能量代謝有關。

〔關鍵詞〕秦皮素；腦缺血再灌注;氧化應激：髓過氧化物酶;ATPase

腦缺血再灌注后自由基生成增多和炎癥反應是導致腦損傷的主要原因〔1〕。近年來，有研究表明香豆素類化合物有很好的抗炎作用及保護腦缺血性損傷的作用〔2〕。秦皮素是傳統中藥秦皮中的香豆素類化合物，來源于木犀科植物白蠟樹的樹皮。現代藥理研究表明，秦皮具有抗氧化，抗炎，抗菌，抗凝血和防治骨質疏松等多種生物學活性〔3〕。近年來的研究主要集中在秦皮素的抗腫瘤和神經保護作用〔4,5〕，本研究觀察秦皮素對腦缺血再灌注小鼠學習記憶及腦組織生化代謝的影響。

1材料與方法

1.1材料秦皮素，購自南京郎澤醫藥有限公司,純度98%；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒、ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍測定試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;DT-200小鼠跳臺儀，成都泰盟科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物與分組實驗前1 d用跳臺法對小鼠進行篩選，淘汰對電擊反應過于遲鈍或敏感的小鼠。將篩選合格小鼠隨機分成五組，每組10只，即假手術組，模型組及秦皮素高劑量組(20 mg/kg)，中劑量組(10 mg/kg)，低劑量組(5 mg/kg)，腹腔注射給藥，連續7 d，假手術組，模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2.2腦缺血再灌注模型的制備根據文獻〔6〕制備腦缺血再灌注小鼠模型，10%水合氯醛(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，將小鼠仰臥固定，切開頸部皮膚，分離兩側頸總動脈，縫合線牽拉，阻斷血流，每牽拉10 min松開10 min，反復3次后縫合皮膚，適宜條件飼養，假手術組只分離兩側頸總動脈但不阻斷血流。

1.2.3學習記憶能力測定〔7〕實驗時將小鼠放入跳臺儀內，適應環境3 min,調節電壓為36 V，通電后小鼠受到電擊的正常反應是跳上跳臺逃避電擊。學習成績用反應時間(小鼠受到電擊后跳上跳臺的時間)和錯誤次數(5 min內小鼠受到電擊的次數)表示，24 h 后再次測試，將小鼠放在平臺上，開始通以電流，記錄小鼠的潛伏期(通電后第1次跳下平臺的時間)和錯誤次數(5 min 內跳下平臺的次數)作為記憶成績。

1.2.4腦組織生化指標的測定取腦組織，用冰生理鹽水制備10%勻漿液，4℃、2 500 r/min,離心10 min，取上清液，按照試劑盒操作步驟進行測定，蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

1.2.5腦組織形態學觀察 取視交叉部位腦組織，依次經4%多聚甲醛固定，蒸餾水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續冠狀切片，片厚5 μm,常規HE染色，觀察腦組織形態學變化。

1.3統計學方法應用SPSS12.0統計軟件行方差分析。

2結果

2.1學習記憶能力測試 缺血再灌注損傷組小鼠的跳臺測試中反應時間延長，受到的電擊次數(錯誤次數)增加，學習能力降低。記憶能力測定顯示，模型組小鼠記憶潛伏期縮短，錯誤次數增加，與假手術組相比差異顯著(P<0.05)，與模型組相比，秦皮素高，中劑量組均可改善腦缺血再灌注小鼠的學習記憶能力(P<0.05)，而秦皮素低劑量組效果不明顯，見表1。

表1　各組小鼠學習記憶成績

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；表2同

2.2腦組織SOD活性、MDA 含量和MPO活性模型組小鼠腦組織SOD活性降低，MDA 含量和MPO活性明顯高于假手術組(P<0.05)。與模型組比較，秦皮素高、中、低劑量組小鼠腦組織SOD活性升高，MDA 含量和MPO活性降低(P<0.05)，秦皮素各劑量組差別無統計學意義，見表2。

2.3秦皮素對小鼠腦組織Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影響與假手術組相比，模型組Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯降低，表明腦組織能量代謝異常。與模型組相比，秦皮素各劑量組腦組織Na+-K+-ATPase活性升高，秦皮素高、中劑量組腦組織Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高(P<0.05)，見表3。

2.4腦組織HE染色HE染色結果顯示，假手術組大鼠海馬結構正常，神經元排列正常，核仁明顯，未見神經元壞死及中性粒細胞浸潤等明顯病理改變，模型組神經元數目明顯減少，排列紊亂，出現程度不同的核深染，核固縮，核體不規則，秦皮素給藥組能減輕神經元及細胞核的損傷，抑制局部組織壞死，提示秦皮素對腦缺血再灌注海馬區神經元有保護作用，見圖1。

表2　秦皮素對小鼠腦組織中SOD活性，MDA

表3　各組小鼠Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

假手術組

模型組

高劑量組

中劑量組

低劑量組

圖1各組小鼠海馬HE染色(×400)

3討論

學習記憶功能障礙是缺血性腦血管疾病患者常見的臨床表現，本研究顯示，腦缺血再灌注損傷小鼠在跳臺測試中反應時間延長，受到的電擊次數增加，記憶潛伏期縮短，學習記憶能力降低，預先給予秦皮素可改善小鼠的學習記憶障礙。腦缺血再灌注損傷的發生是由多種機制參與的復雜病理生理過程，其中自由基的毒性作用和炎癥反應是產生缺血再灌注損傷的關鍵性病理環節〔8〕。SOD具有顯著抗脂質過氧化的作用，其活性與機體的抗氧化能力相關，MDA為脂質過氧化過程中的最終分解產物。研究表明，秦皮素通過抗凋亡和抗氧化作用,具有保護魚藤酮誘導的人成神經細胞瘤細胞的細胞毒作用〔9〕。本研究顯示，秦皮素能降低MDA含量，提高SOD活性，支持秦皮素的神經保護作用與其抗氧化作用密切相關。中性粒細胞含有MPO，其活性程度主要反映中性粒細胞的浸潤程度，因而間接提示局部組織的炎性反應程度，MPO可誘導炎癥相關基因的表達，促進炎癥效應細胞的增殖與活化〔10〕。秦皮素預處理后腦組織MPO活性降低，提示秦皮素對缺血再灌注損傷后中性粒細胞浸潤為標志的炎癥反應有明顯改善作用。能量代謝障礙是缺血性腦細胞損傷發生的另一關鍵環節,而ATP酶活性的改變是神經元損傷的重要環節〔11〕。Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase是存在于生物膜上的一種蛋白酶,在物質運送、能量轉換及信息傳遞方面具有重要的作用,可維持細胞內外離子平衡,維持細胞的興奮性和傳導性,已成為評價神經元質膜功能狀態的標志之一〔12〕。模型組小鼠腦組織ATPase活性下降,神經元質膜的功能異常,引起細胞內Na+和Ca2+增加,從而誘發一系列病理生理反應。本實驗結果表明，秦皮素能明顯提高腦缺血小鼠腦組織Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase活性，提示秦皮素可改善腦組織的能量代謝，對腦缺血再灌注損傷起保護作用。本研究證實，秦皮素對腦缺血再灌注造成的學習記憶減退和組織損傷有明顯的保護作用，其機制涉及抗氧化，抑制炎癥反應和改善腦組織能量代謝。

4參考文獻

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〔2014-12-07修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：泰山醫學院自然科學基金項目(No.2010ZR080)

〔中圖分類號〕R285

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2350-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.016

第一作者：陳美華(1977-)，女，講師，碩士，主要從事神經藥理學研究 。