艾灸不同溫度熱刺激對小鼠神闕穴局部形態及肥大細胞的影響

王應越　王耀帥　李　梅

(南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇　南京　210023)

艾灸不同溫度熱刺激對小鼠神闕穴局部形態及肥大細胞的影響

王應越王耀帥李梅

(南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇南京210023)

〔摘要〕目的探討艾灸不同溫度熱刺激對小鼠神闕穴施灸局部效應的影響。方法觀察艾灸不同溫度(38℃、46℃)熱刺激對小鼠神闕穴施灸局部皮膚形態結構的改變以及肥大細胞的變化。結果不同的溫熱刺激可以不同程度地影響神闕穴局部的結構和細胞。艾灸的熱刺激對C57BL/6J野生型小鼠與TRPV1-/-小鼠皮膚組織形態結構的影響存在差異。辣椒堿化學刺激對小鼠皮膚組織形態結構的影響不明顯。不同溫度的艾灸熱刺激對小鼠神闕穴施灸局部肥大細胞的影響存在差異。46℃的熱刺激能夠明顯的使野生型小鼠局部皮膚肥大細胞數目增多，使肥大細胞脫顆粒。結論艾灸不同的溫熱刺激可以不同程度地影響神闕穴施灸局部組織的結構和細胞，艾灸的熱刺激所致的皮膚神經源性炎癥可能與激活TRPV1相關。

〔關鍵詞〕艾灸；溫熱刺激；肥大細胞；TRPV1；針灸效應

皮膚是艾灸刺激的直接作用部位，局部皮膚適宜溫熱刺激的選擇、刺激的反應特征及啟動相關調節機制的過程均以皮膚的生物學特征為基礎。現代神經生物學研究表明〔1〕，軀體及皮膚組織中分布有感受不同溫度范圍的蛋白受體(瞬時感受器電位家族，TRP)，它們有著各自不同的溫度感受閾值，可被不同的溫熱刺激所激活。艾灸療法引起的局部溫度變化特征，與TRP相關亞型感受溫度的范疇及分布特點有很大的契合，如TRPV1可被熱刺激(>43℃)激活〔2〕。本文擬探究低于和高于43℃的2種溫度的艾灸熱刺激對施灸局部皮膚產生的效應及其是否受到TRPV1激活的影響而存在差異。

1材料與方法

1.1實驗動物2月齡C57BL/6J野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠。C57BL/6J野生型小鼠，體重18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司〔許可證號：SCXK(滬)2007-0005〕，TRPV1-/-小鼠，由南京大學模式動物研究中心提供，將動物飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心(清潔級)內，相同的生存環境，正常進食水。適應性喂養1 w，開始進行實驗。將實驗動物分為正常對照組；TRPV1-/-對照組；艾灸1組；艾灸2組；藥物對照組；TRPV1-/-艾灸對照組。

1.2實驗器材動物用清艾灸條(直徑7 mm，南陽漢醫艾絨有限責任公司)、辣椒素軟膏(長春普華制藥股份有限公司)、溫度測量儀(HC-04型，杭州洪昌科技有限公司)、0.5%甲苯胺藍染液(甲苯胺藍染料0.5 g，用蒸餾水定容至100 ml)、分化液(冰醋酸0.5 ml、蒸餾水99.5 ml混合搖勻)。液狀石蠟、中性樹膠(均為上海標本模型廠)、甲醛、二甲苯、無水乙醇(均為南京寧試化學試劑有限公司)、全自動組織處理儀(TP1020，德國LEICA公司)、石蠟切片機(RM2145，德國LEICA公司)、光學顯微鏡(BX60，日本OLYMPUS公司)、攝像儀(DP71圖像獲取系統，日本OLYMPUS公司)、圖像分析儀(CMIAS98A，北京航空航天大學)、圖像分析軟件(南京大學捷達公司)。

1.3實驗方法

1.3.1艾灸條及藥物干預方法用手術剪刀將實驗小鼠神闕穴局部體毛輕輕剪去，以皮膚完全暴露，但不劃傷為度。神闕穴的定位方法采用擬人比照法。待小鼠行為狀態平穩后置于專用固定架上，各組給予相應的刺激干預。正常對照組：不予野生型小鼠艾灸及藥物干預刺激，平行對照觀察。TRPV1-/-對照組：不予TRPV1-/-小鼠艾灸及藥物干預刺激，平行對照觀察。艾灸1組：用定制的動物用細艾條點燃后，正對野生型小鼠神闕穴，進行艾灸刺激10 min，將溫度控制儀探頭置于施灸穴位皮膚表面以監測實時溫度，通過調節艾條與施灸穴位的距離，將施灸局部皮膚溫度控制在(38℃±1℃)，艾灸2組：干預方法與艾灸1組相似，在艾條灸熱刺激時，將施灸局部皮膚溫度控制在(46℃±1℃)。藥物對照組：予野生型小鼠神闕穴，涂抹適量辣椒堿軟膏。TRPV1-/-艾灸對照組：予TRPV1-/-小鼠神闕穴，艾條灸熱刺激，干預方法同艾灸2組。在干預或平行觀察結束后30 min內，將小鼠拉頸處死，取材。用眼科鑷和手術剪刀快速取出各組小鼠神闕穴局部皮膚組織，放于10%甲醛溶液保存固定1 w。

1.3.2染色前處理(1)修塊：將剪取下放置在10%的甲醛溶液中固定1 w的小鼠神闕穴局部的皮膚組織取出，用手術刀片對組織進行修塊，約0.7 cm×0.7 cm×0.3 cm大小，再放入70%的乙醇中將組織上殘留的甲醛溶液洗去。(2)脫水：將完成修塊的組織放入全自動組織處理儀進行脫水處理。(3)包埋：對經處理后的組織進行石蠟包埋。(4)切片：用切片機進行常規切片，片厚5～6 μm，放入熱水中攤平；再用標記好的載玻片撈片，撈片時速度要慢，起水后迅速甩去水，防止組織和玻片間形成氣泡，若有氣泡要仔細用針灸針戳破；在烤片板上烤至石蠟透明，放入烤片箱中，60℃～64℃烘烤過夜，晾涼后備用。

1.3.3蘇木素-伊紅(HE)染色(1)石蠟切片脫蠟至水；(2)蘇木素染液染色5 min；(3)快速放入1%鹽酸乙醇中進行分化；(4)用清水洗滌后，放入促返藍液中10 min；(5)返藍結束后，梯度酒精上行脫水；(6)二甲苯透明；(7)樹膠封片。

1.3.4甲苯胺藍染色(1)切片常規脫蠟至水；(2)0.5%甲苯胺藍液浸染；(3)水洗，洗去多余染液；(4)分化液分化；(5)水洗、風干；(6)各級酒精脫水；(7)二甲苯透明；(8)中性樹膠封片。

1.3.5圖像采集用光學顯微鏡觀察玻片上組織的形態，找到有效信息，用攝像儀進行圖像的拍攝，拍攝倍數為10×10，再用圖像分析儀及形態學圖像分析系統將獲取的圖像信息進行處理分析。

2結果

2.1HE染色結果圖1可見，(1)正常對照組：穴位局部表皮完整，角化層薄，表皮厚度約有3～5層細胞；表皮結構正常，基底層、棘層以及顆粒細胞層的構成和排列都未見異常改變，真皮層結構正常，膠原纖維束排列致密，染色呈鮮明紅色，其間可見毛囊、皮脂腺散在分布，皮下組織結構正常。(2)TRPV1-/-對照組：穴位局部表皮完整，角化層薄，表皮厚度約有3～5層細胞；結構正常，基底層、棘層以及顆粒細胞層都未見異常改變，真皮層結構出現異常，膠原纖維束排列疏松，其間毛囊顯著大量增生，可見皮脂腺分布，皮下組織結構正常。(3)艾灸1組：施灸局部皮膚角化層極薄且剝離，但表皮完整，只有2～3層細胞；基底層、棘層以及顆粒細胞層分層不明顯；真皮層膠原纖維束排列疏松，有的地方膠原纖維束缺如；膠原纖維束染色呈淡染著色狀，毛囊和皮脂腺部分缺失；皮下組織結構未見明顯改變，未見炎性細胞浸潤。(4)艾灸2組：施灸局部組織形態結構發生變化，局部皮膚角化層剝離缺如、表皮細胞1～2層，真皮改變較大，厚度較正常真皮厚，膠原纖維束發生變性，表現為纖維束不成束狀分布，而呈均質玻璃樣結構改變，局部染色呈紅染著色狀，及其中的毛囊、皮脂腺破壞丟失較多，皮下組織結構不完整，膠原纖維排列疏松，局部出現炎性細胞浸潤。(5)藥物對照組：穴位局部表皮完整，角化層薄，表皮厚度約有3～5層細胞；表皮結構正常，基底層、棘層以及顆粒細胞層都未見異常改變，連續真皮層結構正常，膠原纖維束排列致密，染色呈鮮明紅色，其間可見毛囊、皮脂腺增多，皮下組織結構正常。(6)TRPV1-/-艾灸組：施灸局部組織形態結構發生變化，局部皮膚角化層剝離缺如、表皮細胞1～2層，真皮層結構異常，膠原纖維束發生變性，不成束狀分布，亦呈均值玻璃樣結構改變，其間毛囊顯著大量增生，但破壞丟失較多，皮下組織結構不完整。

2.2甲苯胺藍染色結果圖2可見，通過甲苯胺藍染色顯示組織中肥大細胞。肥大細胞胞質內含有肝素和組織胺等異色性物質遇到甲苯胺藍可呈異染性紫紅色，組織底色為淡藍色。(1)正常對照組：每個鏡下視野內可見2～3個肥大細胞，呈橢圓形，分布較為分散，胞體較小。(2)TRPV1-/-對照組：每個鏡下視野內可見4～5個肥大細胞，呈橢圓形，分布較為分散，胞體較小。(3)艾灸1組：每個鏡下視野內可見7～8個肥大細胞，呈橢圓形，分布適中，胞體稍肥大，有個別出現脫顆粒的結構改變，表現為細胞周圍可見溢出的顆粒存在，以及胞體不再是橢圓形的各種形態改變。(4)艾灸2組：每個鏡下視野內可見15～20個肥大細胞，呈圓形或橢圓形，分布集中，胞體肥大，大多數肥大細胞發生脫顆粒的上述形態學改變。(5)藥物對照組：每個鏡下視野內可見5～6個肥大細胞，呈圓形或橢圓形，分布適中，胞體稍肥大，有部分發生脫顆粒形態改變。(6)TRPV1-/-艾灸組：每個鏡下視野內可見5-6個肥大細胞，呈橢圓形，分布適中，胞體稍肥大，有個別出現脫顆粒形態改變。

圖1　小鼠神闕穴局部皮膚組織HE染色圖片

圖2　小鼠神闕穴局部皮膚組織甲苯胺藍染色圖片

3討論

體表施灸局部是艾灸作用的直接對象，是艾灸溫通效應啟動機制的關鍵環節。在以往的針灸作用機制研究過程中，我們更重視針灸治療對疾病靶器官的效應，而忽略了針灸啟動靶器官效應的獨特途徑和機制。任何有效的治療措施均可對靶器官產生影響，而其作用途徑的特異性則是該方法存在的重要基礎。本實驗關注艾灸施灸局部的效應特點，不僅有助于進一步研究艾灸神經、內分泌、免疫網絡相互作用的途徑，也為闡明艾灸溫通效應的作用機制提供了新的途徑。

本研究表明，艾灸不同的溫熱刺激可以不同程度地影響皮膚組織結構和細胞，局部的這種效應可能與艾灸以溫促通的整體效應相關聯。而TRPV1-/-小鼠與C57BL/6J野生型小鼠在皮膚生理結構上出現了差異，這種差異可能導致了兩者對于46℃熱刺激存在的功能上的差異，提示并不是外界的刺激就一定能對肥大細胞產生影響，而是機體的某種生物學物質也參與到其中。基于以往的研究〔3,4〕，提示皮膚可能是艾灸發揮溫通作用的主要效應區。新近的研究認為皮膚是重要的神經內分泌器官，能夠合成及分泌多種神經遞質及肽類物質〔5〕，而TRP通道很可能是艾灸溫熱效應的重要潛在分子靶點。TRP通道廣泛分布在機體的肥大細胞上〔6〕，主要包括TRPV1和TRPV2，其開放效應直接影響肥大細胞的功能和效用〔5〕。因此，不同的艾灸方法，產生不同的溫度變化特征，激活不同的TRP亞型，誘導不同的生物學效應，最終實現不同的治療效應。而46℃的熱刺激對野生型小鼠與TRPV1-/-小鼠局部皮膚肥大細胞的不同影響提示，TRPV1可能是與局部皮膚神經源性炎癥相關聯的物質。其他研究者皮膚免疫組織化學分析也表明，TRPV1是在大鼠和人皮膚神經纖維中具有特定的神經化學性的一個小直徑初級傳入纖維，數據顯示，TRPV1顯然是與皮膚神經源性炎癥有關〔7，8〕。另外，有研究表明〔9〕，TRPV1可以與C纖維和Aδ纖維的標志物peripherine共表達，提示TRPV1激活后，可以通過該兩種神經纖維通路進行生物效應的級聯反應。綜上所述，艾灸溫通效應的啟動機制與TRPV1相關。TRPV1與艾灸的熱刺激密切相關，參與了艾灸熱刺激引發的皮膚神經源性炎癥反應，TRPV1在局部被艾灸激活之后，通過穴位局部皮膚、肌肉中的血管、神經、體液等，將溫熱的刺激信息轉化為機體能識別的生理的功能信息，產生級聯反應，最終實現溫通效應。

4參考文獻

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〔2015-10-15修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

基金項目：南京中醫藥大學自然科學基金預研項目(No.13XYYZ6)

通訊作者：王耀帥(1983-)，男，講師，博士，主要從事針藥結合與針灸效應研究。

〔中圖分類號〕R245.81

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2345-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.014

第一作者：王應越(1991-)，男，碩士，主要從事針灸治療神經內分泌疾病效應研究。