Embelin通過PI3K/Akt信號途徑抑制甲狀腺癌細胞增殖

那學武　李　揚　王振冉　聶容榮　李　鉑　胡志高　劉曉萌　唐　博

(錦州市中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧　錦州　121000)

1桂林醫學院

Embelin通過PI3K/Akt信號途徑抑制甲狀腺癌細胞增殖

那學武李揚1王振冉1聶容榮1李鉑1胡志高1劉曉萌1唐博1

(錦州市中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的探討Embelin對甲狀腺癌細胞增殖的影響并探討相關機制。方法體外培養甲狀腺癌細胞，經Embelin處理后，RT-PCR和Western印跡檢測XIAP mRNA和蛋白的表達水平；MTT法測定細胞生長抑制率；流式細胞儀測定細胞凋亡率和細胞周期；免疫印跡檢測PI3K、Akt蛋白表達水平。結果Embelin處理甲狀腺癌細胞48 h后，XIAP mRNA和蛋白表達水平明顯降低。在高劑量組中，MTT法檢測其細胞生長抑制率為42.78%±4.29%，明顯高于對照組(t=20.14，P<0.01)；流式細胞儀檢測高劑量組細胞凋亡率為37.94%±2.29%，明顯高于對照組(t=42.09，P<0.01)；流式細胞儀檢測高劑量組細胞周期，發現其處于G1期細胞的百分比為68.23%±2.13%，明顯高于對照組(t高劑量組=5.70，P<0.01)；檢測PI3K、Akt蛋白在高劑量組中的表達水平，發現pAkt蛋白表達水平明顯低于對照組(t高劑量組=6.47，P<0.05)。結論Embelin下調XIAP表達可抑制甲狀腺癌細胞增殖，其作用機制可能與PI3K/Akt信號途徑相關。

〔關鍵詞〕甲狀腺癌；Embelin；XIAP；PI3K/Akt途徑；增殖

恩貝素(Embelin)是X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)小分子抑制劑〔1〕，可以抑制多種腫瘤細胞生長〔2～4〕。本文探討Embelin對甲狀腺癌細胞增殖的影響及相關分子機制。

1材料與方法

1.1主要材料、細胞和分組Embelin購自Sigma公司；L-15培養基，胎牛血清購自Gibco公司；AnnexinV-FITC試劑盒購自BD公司；Caspase-3、8、9，PI3K，Akt，pAkt及XIAP抗體均購自Cell Signaling公司。人甲狀腺癌SW579細胞株購自中科院上海細胞庫。實驗分為4組：對照組，未加入Embelin的SW579細胞；Embelin低劑量組，加入Embelin 50 μg/ml的SW579細胞；Embelin中劑量組，加入Embelin 100 μg/ml的SW579細胞；Embelin高劑量組，加入Embelin 200 μg/ml的SW579細胞。

1.2細胞培養使用加入15% FBS的L-15培養基進行培養。

1.3細胞生長抑制率檢測離心收集細胞并調整密度為1×105/ml。接種于96孔培養板中。待生長至對數期加入不同濃度的Embelin進行處理。各孔加入20 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)37℃溫育4 h，然后加入150 μl DMSO，使結晶充分溶解。用酶標儀檢測細胞在490 nm處的吸光度A值。生長抑制率=(對照組A平均值-實驗組A平均值)/對照組A平均值×100%。

1.4細胞凋亡檢測胰蛋白酶消化并收集實驗各組細胞，按照試劑盒(Annexin V-FITC Kit,BD公司，美國)說明分別加入5 μl的Annexin V-FITC和5 ml的PI，4℃避光染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5細胞周期檢測胰蛋白酶消化并收集實驗各組細胞，70%冷乙醇固定過夜。棄去乙醇，加入DNAStain綜合染液(RNase終濃度50 mg/L，PI終濃度100 mg/L，TritonX-100終濃度1 ml/L)1 ml，室溫避光15 min，流式細胞儀檢測。

1.6RNA提取和RT-PCR分析提取各實驗組細胞的總RNA，定量后用RT-PCR試劑盒(Takara，寶生物，大連)進行RT-PCR反應。具體方法按照試劑盒說明書進行。XIAP上游引物：5′-CCCTCCCAAGAGTTCTCAGTGTC-3′，下游引物：5′-CCAAATGTAGCAGGAAAGGCAAT-3′。β-actin上游引物：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，下游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。所得PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統進行分析。

1.7免疫印跡分析常規收集并裂解各實驗組細胞。測定蛋白濃度，電泳，轉膜，加入一抗，二抗，化學發光試劑，進行灰度分析。

1.8統計學方法應用SPSS17.0軟件行獨立樣本t檢驗。

2結果

2.1Embelin對XIAP表達水平的影響不同劑量的Embelin處理甲狀腺癌細胞48 h，RT-PCR和免疫印跡分析XIAP mRNA和蛋白表達水平。結果顯示，經不同劑量的Embelin處理48 h后，XIAP mRNA和蛋白的表達水平均下調，特別是在200 μg/ml最為明顯(t高劑量組=6.32，P<0.01)(圖1)。說明Embelin可有效下調XIAP基因和蛋白的表達水平。

圖1　Embelin處理后XIAP mRNA和蛋白的表達水平

2.2MTT法檢測細胞生長抑制率Embelin低劑量，中劑量和高劑量組的細胞生長抑制率分別為8.78%±1.38%，23.84%±2.22%，42.78%±4.29%。其中以Embelin高劑量組最為明顯(t高劑量組=20.14，P<0.01)，說明Embelin對甲狀腺癌細胞的生長具有抑制作用，并且具有劑量依賴性。

2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡Embelin高劑量組的細胞凋亡率均明顯高于對照組(t高劑量組=42.09，P<0.01)。說明Embelin可誘導人甲狀腺癌細胞發生凋亡(表1)。

表1　各組細胞凋亡率和周期的比值±s,%,n=5)

與對照組比較：1)P<0.01

2.4流式細胞儀檢測細胞周期在對照組，Embelin低劑量組，中劑量組和高劑量組中G1期的比例逐漸增高，相反，S+G2+M期比例逐漸降低。Embelin高劑量組的G1期百分比明顯高于對照組(t高劑量組=5.70，P<0.01)。說明Embelin可使人甲狀腺癌細胞周期阻滯于G1期(表1)。

2.5Caspase-3、8和9蛋白表達水平檢測與對照組比較，Embelin高劑量組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平明顯升高(Caspase-3：t高劑量組=5.63，P<0.01；Caspase-9：t高劑量組=0.99，P<0.01)，而Caspase-8蛋白表達水平未見明顯變化(t高劑量組=0.54，P>0.05)(圖2)。說明Embelin誘導人甲狀腺癌細胞凋亡可能與線粒體途徑相關。

圖2　免疫印跡檢測Caspase-3、8和9蛋白表達水平

2.6PI3K和Akt蛋白表達水平檢測采用高劑量Embelin和PI3K抑制劑LY294002治療后，免疫印跡分析PI3K、Akt及pAkt蛋白表達水平變化。與對照組比較，Embelin高劑量組pAkt蛋白表達水平明顯降低(t高劑量組=6.47，P<0.05)，而PI3K及Akt蛋白的表達水平未見明顯變化(PI3K：t高劑量組=0.58，P>0.05；Akt：t高劑量組=0.62，P>0.05)；同時，與對照組比較，LY294002組PI3K、Akt及pAkt蛋白表達水平均明顯降低(PI3K：tLY294002組=23.48，P<0.01；Akt：tLY294002組=4.69，P<0.05；pAkt：tLY294002組=0.98，P<0.05)(圖3)。說明Embelin抑制人甲狀腺癌細胞增殖可能與PI3K/Akt信號途徑有關。

圖3　免疫印跡檢測PI3K、Akt及pAkt蛋白表達水平

3討論

抗腫瘤藥物一般都是通過誘導敏感腫瘤細胞發生凋亡或是阻滯細胞周期進程而實現其抗腫瘤作用的。Embelin是XIAP的小分子抑制劑，可特異性抑制XIAP，從而影響多種腫瘤細胞的增殖與凋亡，特別是對胰腺癌、肝癌及乳腺癌等實體腫瘤細胞作用更為顯著〔4～6〕。本研究結果與上述結論相吻合，發現Embelin能誘導人甲狀腺癌細胞發生凋亡并且具有劑量依賴性，說明Embelin可通過誘導甲狀腺癌細胞發生凋亡而抑制其增殖。觸發細胞凋亡主要的信號轉導途徑包括內源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑〔7〕。眾所周知，Caspase家族在細胞發生凋亡時能夠激活凋亡相關蛋白酶，因此，Caspase家族的活化是細胞發生凋亡的重要先決條件〔8〕。本實驗中，給予Embelin處理后發現，甲狀腺癌細胞Caspase-3、9蛋白表達水平明顯升高；然而，Caspase-8蛋白表達水平無明顯變化。細胞色素C從線粒體釋放可激活Caspase-9、3的效應，這是一個凋亡通路中的重要一步〔9〕。這些結果說明，Embelin誘導人甲狀腺癌細胞凋亡可能是通過內源性線粒體途徑實現的。

PI3K/Akt是經典的細胞內信號傳導途徑。研究證實Akt途徑是腫瘤發生發展的重要啟動因子之一〔10〕。Fang等〔11〕研究表明，人工合成抗腫瘤藥mz3(考布他丁)可通過下調Akt的表達，從而進一步下調Cdc2、Cdc25及CyclinB1蛋白表達水平，誘導白血病細胞阻滯于G2/M期。Asselin等〔12〕研究發現，通過下調大鼠粒層棘細胞XIAP蛋白表達可下調磷酸化Akt表達，但Akt蛋白表達不受影響。Hussain等〔13〕研究表明，使用Embelin可以同時下調大B淋巴細胞XIAP及Akt蛋白的表達水平。本研究結果發現，Embelin能明顯抑制甲狀腺癌細胞周期進程，將細胞周期阻滯于G1期以內。同時發現，治療劑量的Embelin能增加Akt蛋白的磷酸化水平，但Akt總蛋白表達并未發生明顯變化。這與上述研究結果有相似之處，說明Embelin抑制人甲狀腺癌細胞增殖與Akt蛋白磷酸化密切相關。

總之，本研究證明，Embelin通過調節XIAP作用于PI3K/Akt信號途徑從而抑制人甲狀腺癌細胞增殖，這將為臨床上甲狀腺癌的治療提供新的藥物靶點。

4參考文獻

1Siegel C,Li J,Liu F,etal.miR-23a regulation of X-linked inhibitor of apoptosis(XIAP)contributes to sex differences in the response to cerebral ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2011;108(28):11662-7.

2Wang A,Zhang B,Zhang J,etal.Embelin-induced brain glioma cell apoptosis and cell cycle arrest via the mitochondrial pathway〔J〕.Oncol Rep,2013;29(6):2473-8.

3Heo JY,Kim HJ,Kim SM,etal.Embelin suppresses STAT3 signaling,proliferation,and survival of multiple myeloma via the protein tyrosine phosphatase PTEN〔J〕.Cancer Lett,2011;308(1):71-80.

4Huang M,Tang SN,Upadhyay G,etal.Embelin suppresses growth of human pancreatic cancer xenografts,and pancreatic cancer cells isolated from krasG12D mice by inhibiting Akt and sonic hedgehog pathways〔J〕.PLoS One,2014;9(4):e92161.

5Taghiyev A,Sun D,Gao ZM,etal.Embelin-induced apoptosis of HepG2 human hepatocellular carcinoma cells and blockade of HepG2 cells in the G2/M phase via the mitochondrial pathway〔J〕.Exp Ther Med,2012;4(4):649-54.

6Allensworth JL,Aird KM,Aldrich AJ,etal.XIAP inhibition and generation of reactive oxygen species enhances TRAIL sensitivity in inflammatory breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther,2012;11(7):1518-27.

7Yang CL,Ma YG,Xue YX,etal.Curcumin induces small cell lung cancer NCI-H446 cell apoptosis via the reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway and not the cell death receptor pathway〔J〕.DNA Cell Biol,2012;31(2):139-50.

8Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA,etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature,1995;376(6535):37-43.

9Riedl SJ,Shi Y.Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2004;5(11):897-907.

10Ching CB,Hansel DE.Expanding therapeutic targets in bladder cancer:the PI3K/Akt/mTOR pathway〔J〕.Lab Invest,2010;90(10):1406-14.

11Fang L,Shen L,Fang Y,etal.MZ3 can induce G2/M-phase arrest and apoptosis in human leukemia cells〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2008;134(12):1337-45.

12Asselin E,Wang Y,Tsang BK.X-linked inhibitor of apoptosis protein activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in rat granulosa cells during follicular development〔J〕.Endocrinology,2001;142(6):2451-7.

13Hussain AR,Uddin S,Ahmed M,etal.Prognostic significance of XIAP expression in DLBCL and effect of its inhibition on AKT signalling〔J〕.J Pathol,2010;222(2):180-90.

〔2014-10-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：廣西衛生廳中醫藥科技專項基金資助項目(GZPT13-45)

通訊作者：唐博(1979-)，男，副主任醫師，副教授，博士，主要從事普外科惡性腫瘤的基礎與臨床研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2340-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.012

第一作者：那學武(1966-)，男，主任醫師，主要從事頭頸外科惡性腫瘤基礎與臨床研究。