PTEN在心肌缺血預適應和后適應中的調(diào)控作用

沈淑文　李春梅　張興華

(山東大學附屬省立醫(yī)院心內(nèi)科，山東　濟南　250014)

PTEN在心肌缺血預適應和后適應中的調(diào)控作用

沈淑文李春梅張興華

(山東大學附屬省立醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟南250014)

〔摘要〕目的探討人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)/Akt信號通路在心肌缺血預適應和后適應中的作用。方法雄性SD大鼠60只，隨機分為4組：假手術組(sham組)、缺血再灌注組(IR組)、缺血預適應組(Ipre組)及缺血后適應組(Ipost組)。建立動物模型，實驗結(jié)束后，計算心肌梗死面積，測定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)活性，檢測缺血心肌PTEN mRNA和蛋白含量及p-Akt蛋白表達水平。結(jié)果與IR組比較，Ipre組和Ipost組的心肌梗死面積明顯縮小，CK、LDH的活性降低，PTEN mRNA和蛋白的含量降低，p-Akt蛋白的水平升高(P<0.05)。結(jié)論PTEN/Akt信號通路在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，心肌缺血預適應和后適應通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號通路的表達在缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護心肌的作用。

〔關鍵詞〕PTEN；缺血再灌注損傷；預適應；后適應；Akt

心肌缺血預適應和缺血后適應可以減少心肌缺血再灌注損傷〔1～3〕，但其機制尚未完全闡明。PTEN是1997年Li等〔4〕在人體新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，它與細胞的生長、分化、凋亡調(diào)控密切相關。以往對PTEN的研究大多側(cè)重于腫瘤方面，近些年發(fā)現(xiàn)PTEN/Akt信號通路在心肌重構(gòu)〔5〕、心肌缺血再灌注損傷〔6〕等方面也發(fā)揮著重要的作用。應用特異性藥物抑制PTEN的活性可縮小心肌梗死后心肌梗死面積，改善心功能〔7〕。因此我們推測，PTEN可能通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號通路調(diào)控參與心肌缺血預適應和后適應的心臟保護作用，基于此本研究擬構(gòu)建SD大鼠心肌缺血假手術、缺血再灌注、缺血預適應及缺血后適應動物模型，通過觀察PTEN其下游信號分子的改變，明確PTEN/Akt信號通路在心肌缺血再灌注損傷中的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑雄性SD大鼠60只，體重(300±20)g，由山東中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供〔生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20110003〕。肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒：南京建成生物研究所；小鼠抗β-actin單抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗小鼠IgG：北京中杉金橋生物科技公司；PTEN兔單抗、p-Akt(Ser473)兔單抗：美國Cell Signaling Technology(CST)公司；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real Time PCR反應試劑盒：TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1動物模型分組及制備雄性SD大鼠60只，隨機分為4組，每組15只。假手術(sham)組：左冠狀動脈前降支僅穿線不結(jié)；缺血再灌注(IR)組：結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注180 min；缺血預適應(Ipre)組：結(jié)扎左冠狀動脈前降支5 min、灌注5 min，反復3次后，結(jié)扎30 min再灌注180 min；缺血后適應(Ipost)組：結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min后，灌注30 s、結(jié)扎30 s，反復3次，再灌注180 min。造模結(jié)束時，每組隨機選取6只，做伊文思藍、TTC染色，用于缺血及梗死范圍的測定；其余9只用于血清心肌酶譜、PTEN mRNA和蛋白及p-Akt蛋白的檢測。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠后，將其仰臥位固定于手術臺上，將心電圖機電極置于大鼠四肢皮下，觀察并記錄心電圖變化。頸部和胸部備皮，用醫(yī)用酒精消毒，氣管插管，連接小型動物呼吸機，呼吸頻率70次/min，潮氣量7.5，呼氣：吸氣為1∶1，靜觀5 min，待大鼠呼吸平穩(wěn)后開胸。沿劍突到左腋下線剪開約3 cm皮膚，逐層分離胸肌，剪開胸骨左緣3-4肋間的肋間肌，用眼瞼撐開器撐開肋骨，剪開心包膜，充分暴露心臟，尋找左冠狀動脈前降支，在左心耳和肺動脈圓錐處結(jié)扎血管。達到缺血時間時松開結(jié)扎線恢復血流。缺血成功標志：心電圖示ST段抬高，心尖處可見心肌發(fā)白、水腫明顯，心尖搏動減弱。再灌注成功標志：再灌注后，抬高的ST段逐漸回落，缺血心肌逐漸恢復正常心肌顏色。

1.2.2血清心肌酶譜CK、LDH的測定分別于缺血前、再灌注結(jié)束后，鎖骨下靜脈采血，將血樣室溫靜置1 h，3 500 r/min離心10 min，收集血清。用酶標儀測定血清CK和LDH水平。

1.2.3心肌缺血及梗死范圍的測定再灌注結(jié)果后，需要做做伊文思藍、TTC染色的大鼠，在原位結(jié)扎左冠狀動脈前降支，將2～3 ml 1%伊文思藍沿心尖注入，待耳朵眼睛變藍后停止，摘取心肌，用生理鹽水洗干凈，見非缺血區(qū)的心肌被染成藍色后，缺血區(qū)未被染成藍色，去除左右心耳、右室，游離左室，將左室置于-20℃冰箱中冰凍30 min，將心臟切成厚約2 mm的切片，再將切片心肌置于1%的TTC磷酸緩沖液中37℃孵育15 min，可見缺血并梗死區(qū)為灰白色，缺血未梗死區(qū)呈深紅色，非缺血區(qū)為藍色，置于4%中性甲醛中固定過夜后，仔細分離這3種顏色心肌，并稱重。缺血區(qū)面積以缺血區(qū)心肌重量占左心室重量百分比來表示，梗死區(qū)面積以梗死區(qū)心肌重量占缺血區(qū)心肌重量百分比表示。

1.2.4RT-PCR檢測心肌PTEN mRNA的表達水平實驗結(jié)束后，摘除心肌，sham組切取左心室心肌(此為正常心肌)，其余三組切取缺血部分心肌，每組各取100 mg心肌組織，用生理鹽水沖洗干凈，用Trizol試劑盒，按試劑盒說明書提取RNA，測定RNA濃度和純度，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列如下：①目的基因PTEN上游引物序列：5'CCAATGGCTAAGTGAAGACGACAA3'；下游引物序列：5'CATAGCGCCTCTGACTGGGAATA3'。②內(nèi)參基因β-actin上游引物：5'GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3'；下游引物：5'GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG3'，每個樣本做2個復孔并按RT-PCR試劑盒說明進行上機反應。

1.2.5Western 印跡法檢測心肌中PTEN、p-Akt表達水平每組各取100 mg心肌組織，加入300 μl含有1%PMSF和1%磷酸酶抑制劑的裂解液，震蕩混勻后冰上靜置20 min。超聲充分裂解后，4℃離心機，20 000 r/min，離心30 min，留取上清液。檢測提取的心肌組織蛋白濃度，并分別定量上樣，進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，牛奶封閉1 h，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，用ECL發(fā)光液顯色。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1血清心肌酶譜CK、LDH的測定缺血前各組血清CK、LDH無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；再灌注180 min末，IR組、Ipre組、Ipost組血清CK、LDH水平較sham組明顯升高(P<0.05)；Ipre組、Ipost組血清CK、LDH水平均顯著低于IR組(P<0.05)，此時這兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2心肌缺血及梗死范圍sham組心肌無明顯缺血；余各組因左前降支結(jié)扎所致心肌缺血面積無差異(P>0.05)；Ipre組、Ipost組的心肌梗死面積較IR組明顯縮小(P<0.05)。Ipre組、Ipost組無差異(P>0.05)。見表2。

表1　各組大鼠血清心肌酶譜含量比較

與sham組比較：1)P<0.05；與IR組比較：2)P<0.05，表3同

表2　各組大鼠心肌缺血及梗死面積比較±s，n=6，%)

與IR組比較：1)P<0.05

2.3RT-PCR法檢測心肌PTEN mRNA的表達變化采用2-△△CT的方法分析各組心肌PTEN mRNA的表達水平。與sham組(1.00±0.21)比較，IR組(2.05±0.59)、Ipre組(1.62±0.27)和Ipost組(1.57±0.34)PTEN mRNA明顯升高(P<0.05)；與IR組比較，Ipre組、Ipost組的PTEN mRNA明顯降低(P<0.05)，且Ipre組、Ipost組兩組間無差異(P>0.05)。

2.4Western 印跡法檢測心肌中PTEN、p-Akt蛋白表達水平與sham組比較，IR組、Ipre組和Ipost組PTEN、p-Akt蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與IR組比較，Ipre組、Ipost組的PTEN蛋白表達明顯降低(P<0.05)，p-Akt蛋白明顯升高(P<0.05)，且兩組間無差異(P>0.05)。見圖1。見表3。

表3　各組大鼠心肌PTEN、p-Akt蛋白表達的

圖1　各組大鼠心肌PTEN、p-Akt蛋白表達水平

3討論

心肌缺血再灌注損傷是指在一定條件下恢復缺血心肌血液供應后，不僅不能使組織、器官功能恢復反而加重組織器官功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。缺血再灌注損傷嚴重影響再灌注的療效。因此降低再灌注損傷，提高療效成為急性心肌梗死治療的重點。本研究提示心肌缺血預適應和后適應可通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號通路，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護心肌的作用。PI3K/Akt信號通路是心肌缺血再灌注中主要的促生存通路〔6〕。Akt是PI3K信號通路最重要的下游信號蛋白，PTEN可以拮抗PI3K，抑制Akt的活性。本研究提示PTEN/Akt信號通路在心肌缺血再灌注損傷中被激活，PTEN/Akt信號通路可能在心肌缺血再灌注損傷分子機制中發(fā)揮重要作用；缺血預適應、后適應降低了PTEN的基因水平及蛋白水平的表達，提高了p-Akt的水平，減輕心肌缺血再灌注損傷。這種保護作用可能與抑制PTEN，激活PI3K/Akt通路有關。活化的Akt能夠作用于下游的靶點，激活抗凋亡蛋白如：p70s6k、eNos、bcl-2的表達，抑制促凋亡蛋白如：GSk-3β、bad、caspase9的表達從而減輕心肌損傷〔6，7〕。由此推斷PTEN在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。Keyes等〔8〕在大鼠心肌缺血再灌注模型中應用PTEN抑制劑，發(fā)現(xiàn)PTEN抑制劑可以減少細胞死亡改善心功能。Ruan等〔9〕和Zu等〔10〕發(fā)現(xiàn)在PTEN基因敲除小鼠的心肌缺血再灌注模型中，心肌存活率較野生型增加。Parajuli等〔5〕利用腺病毒轉(zhuǎn)染PTEN基因，建立心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)PTEN的高表達增加心肌梗死后心肌細胞的凋亡。這些研究證明了抑制PTEN的表達可以保護心肌，上調(diào)PTEN的表達增加心肌壞死。本研究提示預適應、后適應對心臟的保護作用可能是通過抑制PTEN的表達發(fā)揮作用。目前對PTEN的研究還有很多未明，就本研究及國外其他研究〔7,9,10〕所知抑制PTEN的表達對心肌缺血再灌注有保護作用，但長期抑制PTEN的表達可導致腫瘤和心肌肥厚、心力衰竭、心肌纖維化等疾病〔11，12〕。雖有研究〔7〕表明短時間的PTEN抑制近期未引起心肌肥厚，但其遠期影響，作用時間有待進一步解決。

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〔2014-10-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(No.2009QW015)；山東省科技攻關計劃資助項目(No.2007GG20002045)

通訊作者：張興華(1956-)，男，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事心血管疾病研究。

〔中圖分類號〕R541.4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2334-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.010

第一作者：沈淑文(1987-)，女，碩士，主要從事心血管疾病研究。