微小RNA-126在食管癌組織中的表達及其對食管癌EC109細胞增殖和遷移的影響

呂會來　張　麗　溫士旺　張月峰　李　勇　田子強

(河北醫科大學第四醫院胸五科，河北　石家莊　050091)

微小RNA-126在食管癌組織中的表達及其對食管癌EC109細胞增殖和遷移的影響

呂會來張麗1溫士旺張月峰李勇田子強

(河北醫科大學第四醫院胸五科，河北石家莊050091)

〔摘要〕目的探討微小RNA(miRNA)-126在食管癌組織中的表達及其對食管癌EC109細胞增殖和遷移的影響。方法收集該院胸外科手術切除且保存完整的食管癌及相應癌旁組織標本30例，通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測癌組織和癌旁組織中miRNA-126 mRNA表達；miRNA-126 mimi和control轉染EC109細胞，設置陰性對照組(轉染miRNA mimic control)、轉染組、空白對照組(僅轉染試劑)，PCR檢測轉染EC109細胞miRNA-126表達，轉染細胞培養 1、3、5 d 后MTT檢測細胞增殖情況，Transwell小室法檢測細胞遷移活力。結果癌組織中miR-126 mRNA低于癌旁組織(P<0.05)；轉染EC109細胞后miRNA-126在陰性對照組和空白對照組表達量均低于轉染組(P<0.05)；三組轉染EC109細胞隨著培養時間延長，細胞OD值均逐漸升高(P<0.05)，培養第3、5天細胞OD值組間差異顯著(P<0.05)，其中轉染組EC109細胞OD值均低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；轉染EC109細胞遷移活力檢測結果顯示，轉染組OD值低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。結論食管癌組織中miRNA-126低表達，并且對食管癌EC109細胞增殖和遷移具有一定抑制作用。

〔關鍵詞〕食管癌；微小RNA-126：細胞增殖；細胞遷移

早發現、早診斷和早治療對食管癌患者預后至關重要。微小RNA(miRNA)與腫瘤、心血管疾病的發生、發展密切相關〔1〕。miRNA-126主要位于表皮生長因子樣結構域基因的7號內含子。目前已有研究表明，miRNAs(miRNA-21，miRNA-133a、miRNA-138等)表達失調對食管癌的發生發展具有重要作用，而對于miRNA-126與食管癌研究較少。本文旨在探究miRNA-126對食管癌發生及EC109細胞增殖和遷移的影響。

1資料與方法

1.1一般資料收集我院胸外科2012年1月至2015年1月手術切除的食管癌患者的癌組織以及相應癌旁組織(距離癌組織5 cm以外)標本30例，食管癌患者經病理確診，排除術前接受放化療者，男18例，女12例，鱗癌23例，腺癌7例，所有標本均保存完好，可以收集到患者完整手術和檢測資料，本次研究符合家庭倫理道德，并且家屬或者患者簽署知情同意書等。

1.2實驗材料人EC109細胞購自上海研域生物科技有限公司，澳洲胎牛血清(FBS)，RPMI-1640培養基，雙抗購自南京建成生物研究所；人micrON?miRNA-126 mimic和micrON?miRNA mimic control均購自廣州市銳博生物科技有限公司。Trizol總的RNA抽取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒購自北京華大蛋白質研發中心有限公司，實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒、TaKaRa RNA kit購自大連寶生物工程有限公司。Polytrans高效轉染試劑購自武漢維諾賽生物技術公司。噻唑藍(MTT)試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海碧云天生物科技公司；Transwell 小室購自美國 Corning 公司。實驗所使用的各種儀器、用具均由我院實驗室提供。

1.3研究方法

1.3.1引物設計引物的設計和合成均由金斯瑞生物科技有限公司承擔，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參照。miRNA-126：正義5′AAGAAGCCAGCCCACAAGG-3′,反義5′CTGGCGGAGGAGAATCAGTC-3′；GAPDH：正義5′ACTTGCCTCGAAGCCATCAA-3,反義5′GGGTGGAGTCGTACTTGAGC-3。

1.3.2食管癌組織和癌旁組織miRNA-126表達取適量癌組織和癌旁組織進行總RNA提取，應用紫外分光光度儀分別測定A260和A280值以確定所提取的RNA純度(RNA純品OD260/OD280在1.8～2.0)，置-80℃保存待用，所有的步驟都嚴格按照Trizol總的RNA抽取試劑盒操作說明進行。按照反轉錄試劑盒的操作要求將RNA逆轉錄為cDNA模板，置于-20℃保存備用。引物使用前按照要求稀釋所需濃度，按照RT-PCR試劑盒要求步驟嚴格進行，加完試劑后PCR儀進行檢測，按照二步法進行，反應條件為預變性：95℃，30 s，1個循環。PCR擴增：95℃，5 s，60℃，30 s，40個循環。

1.3.3miRNA-126 mimic和control轉染EC109細胞以及PCR檢測miRNA-126EC109細胞接種于含有15% FBS、1 ml雙抗的RPMI-1640培養液中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，隔天觀察細胞形態和生長狀態，細胞鋪滿整個培養瓶80%后，將對數期生長良好經過消化按照1×106個/孔接種于6孔板中，每孔加入3 ml培養液，培養細胞過夜觀察細胞融合50%左右，按照Polytrans高效轉染試劑要求步驟轉染miRNA-126 mimic于EC109細胞，實驗設置陰性對照組(轉染miRNA mimic control)、轉染組、空白對照組(僅轉染試劑)。

細胞轉染后繼續培養24 h，觀察細胞轉染后狀態，利用總RNA提取、反轉錄、RT-PCR試劑盒按照說明書要求步驟嚴格進行，檢測各組中miRNA-126表達。

1.3.4轉染EC109細胞增殖和遷移活性檢測細胞轉染后培養，將對數期生長良好的細胞，按照7 000個/200 μl/孔接種于96孔板，每組均設置5個復孔，同時設置凋零組(只加培養液)，按照實驗設計分別培養 1、3、5 d 后，避光每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續培養4～6 h，吸去上清液，按照150 μl/孔加入DMSO，輕振蕩后，在酶標儀550 nm波長處檢測，各組吸光度(OD)，細胞增殖率=(實驗組-凋零組)/(空白對照組-凋零組)×100%。應用Transwell 小室法檢測轉染EC109細胞遷移活力，將Transwell小室放入24孔板中，上室內盛裝上層培養液，下室內盛裝下層培養液，將細胞按照50 000個/孔接種于上室。腫瘤細胞常用8.0、12.0 µ膜上室種腫瘤細胞，下室加入FBS，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。細胞培養20 h后取出Transwell小室將內面擦凈，甲醛固定細胞，結晶紫染色，以33%乙酸溶液溶解結晶紫，酶標儀532 nm測量OD值。

1.4統計學方法應用SPSS13.0軟件進行t檢驗、方差分析、χ2檢驗。

2結果

2.1食管癌組織和癌旁組織中miR-126 mRNA 的表達水平癌組織中miR-126 mRNA的相對表達量(0.42±0.07)與癌旁組織(1.01±0.04)差異顯著(t=3.452，P=0.026)。

2.2miRNA-126 mimic轉染EC109細胞miRNA-126表達PCR檢測miRNA-126表達，其中陰性對照組為1.04±0.07，空白對照組為1.10±0.07，轉染組為57.37±12.15，差異顯著(F=6.785，P=0.000)，其中陰性對照組和空白對照組表達量分別與轉染組相比差異顯著(t=5.675、4.882，P=0.025、0.017)，陰性對照組和空白對照組相比無差異(t=0.563，P=0.238)。

2.3miRNA-126 mimic對轉染EC109細胞增殖影響三組轉染EC109細胞隨著培養時間延長，細胞OD值均逐漸升高(P<0.05)，培養第1天三組無統計學差異(P>0.05)，培養第3、5天差異顯著(P<0.05)，其中轉染組EC109 細胞OD值均低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組無差異(P>0.05)。見表1。

表1　三組轉染EC109細胞不同培養時間OD比較±s)

與轉染組比較：1)P<0.05

2.4miRNA-126 mimic對轉染EC109細胞遷移的影響酶標儀532 nm測量經過33%乙酸溶液溶解結晶紫OD值，轉染組為(0.31±0.05)，陰性對照組為(0.45±0.09)，空白對照組為(0.48±0.07)，差異顯著(F=3.179，P=0.041)，其中轉染組OD值低于陰性對照組為和空白對照組(t=3.455、3.586，P=0.035、0.032)，對照組和空白對照組無統計學差異(t=1.235，P=0.085)。

3討論

miRNAs是具有調控功能的非編碼RNA〔2〕，一系列核酸酶剪切修飾，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體(RISC)，通過堿基互補配對識別靶mRNA 3′端非轉錄區域(3′UTR)負性調節靶基因的表達，并且互補程度指導RISC降解或者抑制靶mRNA翻譯，大量研究發現〔3〕miRNA參與各種調節途徑，與腫瘤發生、發展等密切相關。目前為止，只有小部分miRNAs生物學功能得到闡明，比如miR-273和lys-6編碼的miRNA，參與線蟲的神經系統發育過程〔4〕；miR-430參與大腦發育〔5〕；miR-181血細胞分化為B細胞〔6〕；miR-375調胰島細胞發育和胰島素分泌〔7〕；miR-143在脂肪細胞分化起作用；miR-196參與了哺乳動物四肢形成，miR-1與心臟發育有關等。最近研究發現〔8〕miRNA表達與多種癌癥相關，大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點，說明miRNAs在腫瘤發生過程中起至關重要的作用。

有研究報道miRNA-21、miRNA-16、miRNA-25、miRNA-199等〔9〕均在食管癌組織中高表達，miRNA-133a、miRNA-138、miRNA-195、miRNA-200b等〔10〕在食管癌組織中低表達。本研究說明miRNA-126基因可能在食管癌的發生、發展中起著重要抑制作用，是抑癌因子。miRNA在調節食管癌生物特點同樣起著重要作用，研究將miRNA前體序列、類似物等轉染后相應食管癌細胞能上調miRNA，提示可以通過此特性檢查食管癌細胞變化情況。

miRNA-126可以抑制食管癌細胞增殖和遷移，本研究說明轉染后miRNA-126的表達可能抑制食管癌細胞增殖，并且細胞增殖幅度小于對照組等；另外，經轉染EC109細胞遷移活力減弱，與其他miRNA在食管癌中作用類似，這可能與miRNA-126和靶基因結合有關。決定區丫框蛋白2(SOX2)是miR-126主要靶基因，SOX2靶基因可能在miR-126影響細胞遷移和增殖中起著重要作用，對于具體機制還需要進一步深入研究。

食管癌組織中miRNA-126低表達，且對EC109細胞增殖和遷移有抑制作用，但是miRNA-126在食管癌組織和細胞中作用是通過哪種途徑或者靶基因還需要進一步深入研究。

4參考文獻

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10楊洋，闞清，張盼.miRNA-126靶基因預測及其相關信號通路的生物信息學分析〔J〕.中國當代兒科雜志，2013；15(3)：227-9.

〔2015-07-10修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：河北省醫學科學研究重點課題計劃(No.20150303)

通訊作者：田子強(1969-)，男，博士，主任醫師，主要從事胸部腫瘤基礎與臨床方面的研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2332-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.009

1河北醫科大學第三醫院干部病房

第一作者：呂會來(1980-)，男，博士，主治醫師，主要從事胸部腫瘤基礎與臨床方面的研究。