雌二醇對去勢大鼠局灶性腦缺血后小窩蛋白-1和血管內皮生長因子表達的影響

劉柏炎　宋曉玲　易　健　陳雪梅

(湖南中醫藥大學，湖南　長沙　410007)

雌二醇對去勢大鼠局灶性腦缺血后小窩蛋白-1和血管內皮生長因子表達的影響

劉柏炎宋曉玲易健陳雪梅

(湖南中醫藥大學，湖南長沙410007)

〔摘要〕目的探討去雌二醇對去勢大鼠局灶性腦缺血(MCAO)后小窩蛋白(caveolin)-1和血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法60只雌性大鼠，切除卵巢復制去勢模型，隨后采用大腦中動脈線栓法復制MCAO模型，隨機分組為假手術組、去勢(OVX)模型組、腦缺血模型組(MCAO組)、去勢后聯合MCAO組(雙模型組)和雌激素組，采用免疫組織化學法檢測各組動物腦內caveolin-1、VEGF的表達，同時評價其神經功能。結果在正常大鼠腦內有一定量caveolin-1、VEGF陽性細胞，去勢對其影響不明顯，腦缺血后caveolin-1、VEGF陽性細胞增加，與MCAO組與雙模型組比較，雌激素能改善模型大鼠的神經功能缺失癥狀，增強caveolin-1、VEGF的表達(P<0.05)。結論雌激素能增加去勢大鼠局灶性腦缺血后caveolin-1、VEGF的表達，是其抗腦缺血的可能作用機制之一。

〔關鍵詞〕雌激素；局灶性腦缺血；去勢；caveolin-1；VEGF

腦卒中作為中老年常見的急性腦血管疾病，是致殘致死的主要因素之一。臨床流行病學發現缺血性腦卒中發病率存在男女性別差異，絕經前女性發病率低于同齡男性，絕經后其發病率較絕經前顯著增加〔1,2〕。生理水平的雌激素治療可降低卒中發生的相對危險度和死亡率〔3〕，但其作用機制尚未見完全明確。小離蛋白(caveolin)-1與血管內皮生長因子(VEGF)可能在腦缺血損傷和修復中扮演了重要作用〔4,5〕，本文擬從caveolin-1、VEGF角度探討雌激素抗腦缺血的作用機制。

1材料與方法

1.1藥物及主要試劑戊酸雌二醇片(補佳樂)購自拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，麻油溶解為終濃度500 μg/ml，冷藏備用。小鼠抗大鼠 VEGF單克隆抗體、小鼠抗大鼠 caveolin-1抗體購自Abcam公司，SABC 免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自Zymed公司。

1.2主要儀器德國 Leica 公司 RM2235石蠟切片機，日本olympus公司BX51光學顯微鏡及Image-Pro Express圖像分析系統。

1.3動物分組與給藥雌性特殊清潔級(SPF)Wistar大鼠，280～300 g，湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。大鼠隨機分為去勢模型組(OVX組)、腦缺血模型組(MCAO組)、去勢后聯合腦缺血組(雙模型組)、雌激素組，動物局灶性腦缺血術后7 d處死，剔除死亡動物外每組12只；另設假手術組6只。根據文獻〔6〕雌激素組口服給予戊酸雌二醇溶液500 μg·kg-1·d-1，其他各組動物均給予等體積無菌蒸餾水，自由飲食、活動。

1.4動物

1.4.1去勢造模(OVX)參照文獻〔6〕將60只大鼠10%水合氯醛(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉后，腹位固定，腋下2 cm切開腹腔，切除卵巢(假手術組只切除小塊脂肪)，縫合術后予以抗感染處理。如法摘除另一側的卵巢。手術后第5天開始每天取其陰道分泌物涂片，每天一次，連續5 d，以不出現動情周期反應確定造模成功。

1.4.2局灶性腦缺血(MCAO)造模參照文獻改良Zea等〔7〕的大腦中動脈線栓法建立MCAO大鼠模型：10%水合氯醛(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉后，將去勢雌鼠固定，頸正中切口游離右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，結扎頸總動脈、頸外動脈，于頸總動脈分叉部下方剪一小口，將一預先燒成圓頭的尼龍線插入頸內動脈，直到遇到輕微阻力為止，插入深度由分叉部計為(17～20)mm，固定尼龍線，依次關閉切口。假手術組僅切開皮膚、分離右側頸總動脈后即縫合。動物蘇醒后神經功能評分1～3分入者組。

1.5觀察指標

1.5.1神經功能評分參照文獻〔7〕方法進行5級評分。各組動物在手術后2 h和處死前2 h進行評分。

1.5.2紅四氮唑(TTC)檢測參照文獻〔7〕將大鼠以10%水合氯醛(4.0 mg/kg)麻醉后，斷頭取腦，用0.01 mol/L PBS沖洗后立即放入-34℃冰箱快速冷凍30 min后去掉嗅球、小腦和低位腦干，自額極后2 mm做等距離5個冠狀切片，腦片用2%濃度TTC染色，37℃避光水浴染色30 min，正常組織呈紅色，梗死組織為白色。拍成數碼照片拷入電腦，運用Image-Pro Express圖像分析系統計算非梗死區面積，梗死面積的百分比(IS%)按Swanson方法〔8〕進行校正。IS%=(健側總面積-患側非梗死區面積)/2×健側總面積×100%。

1.5.3VEGF、caveolin-1檢測采用免疫組化SABC法檢測，DAB顯色，其中VEGF濃度為1∶300，caveolin-1濃度為1∶500。大鼠以10%水合氯醛(4.0 ml/kg)麻醉后，4℃的4%多聚甲醛經心臟灌注固定，冠狀切片。每只動物取切片5張，置于100倍物鏡下，每張切片隨機選5個視野，用Olympus MicroImage 4.0 圖像處理系統自動計數免疫陽性細胞數。

2結果

2.1雌二醇對大鼠腦缺血面積及神經功能的影響用藥前MCAO組、雙模型組、雌激素組神經功能缺失癥狀積分和缺血面積三組間無顯著性差異，但與假手術組和OVX組比較差異顯著(P<0.05)；治療后雌激素組在改善神經功能缺失癥狀和減少腦缺血面積上與MCAO組、雙模型組有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1　補陽還五湯對大鼠腦缺血面積及

與MCAO組比較：1)P<0.05；與雙模型組比較：2)P<0.05；與假手術組和OVX組比較：3)P<0.05

2.2雌二醇對模型大鼠VEGF、caveolin-1表達的影響在正常腦組織中VEGF、caveolin-1均有一定程度的表達，腦缺血后MCAO組、雙模型組、雌激素組VEGF、caveolin-1表達增加，與假手術組、OVX組比較有顯著性差異(P<0.05)，且雌激素組能明顯增加VEGF、caveolin-1表達，與MCAO組、雙模型組差異均有顯著性(P<0.05)。見表2。

表2　補陽還五湯對大鼠缺血腦內caveolin-1、

與MCAO組比較：1)P<0.05；與雙模型組比較：2)P<0.05

3討論

腦血管阻塞后，缺血周圍區組織由于血流的低灌注引起細胞的繼發性損傷，因此，重建周圍區微循環、恢復組織血流供應對功能康復有著重要的意義。

腦缺血后半暗區組織血運重建的好壞對患者功能恢復有顯著影響〔9〕，而血管新生是血運重建的物質基礎。血管新生包括內皮祖細胞增殖、移行、管腔形成和出芽等多個環節，受眾多因素調節。VEGF作為一種特異性作用于血管內皮細胞的促有絲分裂原，在血管新生中起重要作用。當組織低氧、缺血時，VEGF表達增強并與其特異性受體結合而發揮生理作用。研究發現，VEGF過表達、低表達大鼠和VEGF野生型大鼠在腦缺血損傷后VEGF過表達大鼠腦梗死體積最小〔4〕。caveolin-1不僅是細胞質膜微囊的最主要結構組分，也是其功能蛋白，caveolin-1通過其腳手架結構域與eNOS、PKC等多種信號分子結合，調節信號轉導過程，參與細胞的多種生理、病理活動〔5〕。研究表明，caveolin-1參與了腦缺血損傷和組織修復過程，如局灶性腦缺血后caveolin-1基因缺失小鼠腦水腫和梗死面積加重，神經功能恢復速度明顯減緩〔10〕；抑制caveolin-1可抑制缺血周邊腦組織的血管新生〔11〕。更有學者發現，caveolin-1能影響氧糖剝奪/復氧損傷的人臍帶血內皮祖細胞中VEGF表達〔12〕，caveolin-1敲除小鼠腦缺血后，血管功能不能有效恢復，對VEGF的刺激無反應，血管新生減弱。本實驗發現，腦缺血后VEGF和caveolin-1表達顯著增加，去勢可減少兩者的表達，但仍高于假手術組；VEGF與Careolin-1表達規律相似，但cavedin-1表達強度明顯弱于VEGF?？梢?，caveolin-1參與了VEGF信號轉導通路。

雌激素作為類固醇類激素，已經證實與腦卒中的發生有密切關系〔1〕，研究發現去勢大鼠腦缺血面積顯著增加、神經功能缺損嚴重，給予雌二醇治療可減少梗死面積，促進神經功能恢復〔13〕。目前認為其抗缺血損傷與改善血流供應、抗氧自由基損傷和抑制凋亡等有關〔14〕，但機制尚未完全明確。相關研究發現雌激素呈劑量依賴性地刺激培養的腦血管內皮細胞分泌VEGF和新血管形成〔15〕。生理濃度雌二醇在正常氧條件下促進體外視網膜毛細血管內皮細胞 VEGF表達，低氧條件下通則降低VEGF表達〔16〕。雌二醇還能促進血管平滑肌細胞caveolin-1基因表達〔17〕，通過調節caveolin-1表達而促進內皮祖細胞增殖〔18〕。本研究發現，雌激素治療后神經功能缺損積分減少，且能顯著增加careolin-1和VEGF的表達。

本實驗首次證實，去勢大鼠腦缺血損傷后caveolin-1與VEGF陽性細胞數少于單純腦缺血大鼠，予以雌激素治療后，動物神經功能恢復明顯，caveolin-1與VEGF表達增強，提示影響VEGF及caveolin-1是雌激素抗腦缺血損傷的又一可能機制。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯李相軍)

基金項目：國家自然科學基金項目(30873355，81273989)；湖南省教育廳創新平臺項目(12K089)

〔中圖分類號〕R743.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2321-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.005

第一作者：劉柏炎(1970-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事中西醫結合防治心腦疾病與干細胞研究。