紅車軸草異黃酮對認知損害大鼠NF-κB信號通路及突觸可塑性的調節作用

盧盛娟　林　興　雷丹青

(廣西醫科大學，廣西　南寧　530021)

紅車軸草異黃酮對認知損害大鼠NF-κB信號通路及突觸可塑性的調節作用

盧盛娟林興雷丹青

(廣西醫科大學，廣西南寧530021)

〔摘要〕目的探討紅車軸草異黃酮對Aβ1～42致大鼠認知功能損害的保護作用。方法將75 只Wistar大鼠隨機分為五組，除假手術組外，其余大鼠海馬雙側注射Aβ1～42肽建立認知功能損傷模型，治療組灌胃給予紅車軸草異黃酮，連續3 w。采用免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬神經元退行性。TUNEL法測定各組大鼠海馬神經細胞的凋亡率；ELISA實驗檢測各組大鼠海馬組織中白細胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達情況；Western印跡法檢測海馬組織中核因子(NF)-κB信號通路相關蛋白和突觸可塑性相關蛋白的表達情況。結果紅車軸草異黃酮能改善Aβ1～42致大鼠的學習記憶障礙。進一步研究表明，紅車軸草異黃酮可顯著減弱海馬神經元退行性，降低Aβ1～42致海馬IL-1β和TNF-α的過度表達；減弱星形膠質細胞和小神經膠質細胞的增生，明顯抑制海馬NF-κB的活化。此外，紅車軸草異黃酮還可增加突觸可塑性相關蛋白和腦源性營養因子(BDNF)水平。結論紅車軸草異黃酮對Aβ1～42誘導的學習和記憶損傷有明顯改善作用，其機制可能與抑制NF-κB活化，減少神經炎癥、調節突觸可塑性相關蛋白的表達，以及提高BDNF水平有關。

〔關鍵詞〕紅車軸草異黃酮；認知功能損害；核轉錄因子-κB；腦源性營養因子；突觸

1材料與方法

1.1藥物和試石杉堿甲陽性對照藥〔4〕，購自重慶市渝中制藥廠；紅車軸草異黃酮購自南寧千金子中草藥有限公司；Aβ1～42肽(美國Sigma-Aldrich公司)，溶解于0.1 mmol/L無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)配成1 μg/μl的濃度。

1.2實驗動物及給藥Wistar大鼠，SPF級，10周齡，體質量(300±20)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。大鼠75 只隨機分為假手術對照組、Aβ1～42處理組、石杉堿甲(0.05 mg/kg)陽性對照治療組、紅車軸草異黃酮(10 mg/kg)低劑量組、紅車軸草異黃酮(20 mg/kg)高劑量組。參照已有的研究，于Aβ1～42處理組大鼠海馬雙側立體定向注射Aβ1～42肽2 μl(1 μg/μl)〔5〕。假手術對照組，注射相同體積的PBS。各組動物在同樣條件下飼養1 d后，石杉堿甲治療組和紅車軸草異黃酮治療組分別灌胃給予石杉堿甲(0.05 mg/kg)和紅車軸草異黃酮(10、20 mg/kg)；假手術對照組和Aβ1～42處理組，均給予等體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續3 w。

1.3腦組織病理檢查首先取部分腦組織馬上放入4%的多聚甲醛溶液，常規脫水、石蠟包埋，組織切片，H-E染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.4大鼠海馬神經細胞凋亡的檢測采用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL法)。將生長于24孔板中蓋玻片上不同條件下培養的大鼠海馬神經細胞用0.1%的NaBH 4和0.1%的Triton X-100處理過的細胞用4%多聚甲醛固定后，40 μm冷凍切片，將載玻片與含有脫氧核糖核酸末端轉移酶和異硫氯酸熒光-鄰苯二甲酸二十一烷莖酶(FITC-DUDP)的混合物培養反應 1 h。用 4'-6'-二脒基-2-苯基吲哚二氫氯化物吲哚(DAPI)進行染色，每份樣品隨機選取視野，然后于熒光顯微鏡下分析計數，計算細胞凋亡指數。

1.5大鼠海馬中白細胞介素(IL)-1β，腫瘤壞死因子(TNF)-α活性的檢測采用夾心酶聯免疫吸附試驗法(ELISA法)進行測定，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6Western印跡檢測海馬組織中核轉錄因子(NF)-κB信號通路相關蛋白和突觸可塑性相關蛋白的表達采用Western印跡檢測NF-κB p65，磷酸化NF-κBp65，IκBα，腦源性神經營養因子(BDNF)，神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，凝集素B4(IB4)，突觸泡蛋白，p-IκBα的表達，以β-actin作為內參，用圖像處理系統進行分析。檢測方法參見文獻〔6〕。

2結果

2.1紅車軸草異黃酮對神經元退行性的影響Aβ1～42處理組大鼠神經元表現出嗜酸變性，核固縮和神經元序列錯亂。紅 車軸草異黃酮(20 mg/kg)治療組與Aβ1～42處理組比較，神經元退行性得到緩解(P<0.05)。見圖1。

2.2紅車軸草異黃酮對海馬神經細胞凋亡數的影響Aβ1～42處理組與假手術對照組比較，海馬凋亡細胞顯著增加。經紅車軸草異黃酮或石杉堿甲治療后Aβ1～42所致的細胞凋亡數顯著減少。見圖2。

這款眾泰E200純電動車，采用的是杭州杰能動力有限公司提供的動力電池組，其電能量為24.5kWh，最大持續工作電流為75A，工作電壓范圍為264～369V。通過BMS實測電池組的總電壓較低，不在規定范疇內。正常情況下，單體電池電壓一般為3.64V左右，變化范圍為3.0～4.2V。但在檢測時(圖3)，卻發現有的單體電池的電壓已高達6.40V(圖4)，這是極不正常的情況。動力電池整體電壓偏低，而某些單體電池電壓異常偏高，說明電池組已出現部分異常損壞。

2.3紅車軸草異黃酮對TNF-α和IL-1β蛋白表達的影響見表1。Aβ1～42處理的模型組與假手術對照組比較，海馬組織IL-1β和TNF-α蛋白表達顯著增加(P<0.05)。Aβ1～42誘導的大鼠IL-1β和TNF-α水平增加，而用紅車軸草異黃酮治療后IL-1β和TNF-α水平顯著降低。

①假手術對照組；②Aβ1～42處理組；③石杉堿甲治療組；④低劑量紅車軸草異黃酮治療組；⑤高劑量紅車軸草異黃酮治療組；下圖同圖1　紅車軸草異黃酮對神經元退行性的影響(HE，×400)

圖2　紅車軸草異黃酮對海馬神經細胞凋亡數的影響(TUNEL法，×200)

組別TNF-αIL-1β假手術對照組38.5±4.31)26.8±3.91)Aβ1～42處理組298.9±20.6212.5±20.4石杉堿甲治療組214.8±18.81)157.6±16.21)低劑量紅車軸草異黃酮治療組153.5±16.61)123.2±10.31)高劑量紅車軸草異黃酮治療組125.9±13.81)98.9±8.41)

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

2.4紅車軸草異黃酮對NF-κB活性的影響Aβ1～42誘導的大鼠模型組與假手術對照組比較，海馬NF-κBp65，P-p65蛋白表達顯著升高，而給予紅車軸草異黃酮治療后，其蛋白表達均顯著降低，紅車軸草異黃酮能明顯促進IκBα蛋白的表達和抑制IκBα的磷酸化。見表2，表3。

表2　Western印跡法檢測海馬組織中

表3　Western印跡法檢測海馬組織中IκBα與

2.5紅車軸草異黃酮對突觸泡蛋白水平的影響Aβ1～42誘導的大鼠模型組突觸泡蛋白水平(0.29±0.02)比假手術對照組(0.63±0.03)顯著降低，而用紅車軸草異黃酮治療后，突觸泡蛋白水平呈顯著增加(低、高劑量組分別為0.51±0.04、0.58±0.04)，且石杉堿甲也不能增加突觸泡蛋白水平(0.36±0.03)。

2.6紅車軸草異黃酮對BDNF的影響BDNF集中分布在海馬組織中。同時，Aβ1～42誘導的大鼠模型組，BDNF蛋白表達(0.11±0.03)較假手術對照組(0.38±0.02)顯著減少，紅車軸草異黃酮能阻礙Aβ1～42誘導的BDNF水平降低(低、高劑量組分別為0.17±0.03、0.22±0.03)，石杉堿甲不能提高BDNF水平(0.16±0.03)。

2.7紅車軸草異黃酮對膠質的影響Aβ1～42導致小膠質細胞和星形膠質細胞大量活化，從而增加GFAP和IB4水平。紅車軸草異黃酮能顯著降低GFAP、IB4水平；同時，石杉堿甲不能抑制兩者水平。見表4。

表4　Western印跡法檢測海馬組織中

3討論

Aβ1～42是AD形成和發展的關鍵因素，是誘發AD的多種原因的共同病理基礎〔7〕。前期實驗已證實，降低Aβ1～42在大腦內的蓄積量可以緩解并減輕AD的癥狀。故本實驗考慮采用Aβ1～42建立認知功能損傷動物模型。

AD的發病機制尚不清楚，目前普遍認為Aβ是治療AD的有效靶分子〔8〕。石杉堿甲是從民間草藥千層塔(蛇足石杉,Huperzia serrata)中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體〔9〕。近年研究發現,石杉堿甲通過提高抗氧化酶活力，具有明顯的抗Aβ毒性作用〔10〕。石杉堿甲對比已經上市的治療AD藥物E2020，他克林，毒扁豆堿等，能更好地改善老年記憶力衰退，對AD有很好的療效〔11〕。因此，選用石杉堿甲作為本實驗治療Aβ1～42所致大鼠記憶和認知功能障礙的陽性藥。

Aβ1～42主要是通過細胞內激活胱天蛋白酶-3〔12〕途徑引發細胞凋亡。本實驗中Aβ1～42處理組可見大量凋亡神經細胞，經紅車軸草異黃酮或石杉堿甲治療后，凋亡數顯著減少。提示紅車軸草異黃酮能顯著減弱海馬神經元退行性。

IL-1β介導AD的炎癥反應過程，并處于炎癥反應鏈的前端，是炎癥級聯反應中重要的始動因子,可進一步促進其他炎癥介質的合成和釋放，如IL-6、NF-κB、TNF-α〔13〕。BDNF是由119 個氨基酸組成的堿性蛋白，作為神經營養因子家族的重要成員，BDNF〔14〕在成年期中樞神經系統多個腦區調節突觸傳遞和突觸可塑性，參與學習和記憶的形成，并改善記憶，恢復受損的認知功能。通過研究發現，Aβ1～42處理組IL-1β、TNF-α、NF-κB大量表達，而BDNF表達量降低，紅車軸草異黃酮組其表達量情況剛好與Aβ1～42處理組相反，可見改善大鼠認知功能損害與紅車軸草異黃酮促進 BDNF的表達，抑制IL-1β、TNF-α的表達和NF-κB的活化密切相關。

近年研究表明，隨著年齡增長而記憶功能逐漸下降的原因是由于突觸功能的退化，而不是神經元的缺失〔15〕。Aβ的突觸毒性可能導致記憶障礙。在實驗模型中，發現Aβ1～42能引起海馬突觸泡蛋白水平顯著降低，而突觸泡蛋白是一種特定突觸前標記物，這與前期研究發現的Aβ側腦室注射產生突觸毒性有關〔16〕。本實驗顯示，給予紅車軸草異黃酮治療后突觸泡蛋白的表達顯著升高，表明紅車軸草異黃酮對海馬完整突觸的保護作用可能是其改善認知功能惡化的神經生物學基礎的結果。

中樞炎癥反應與周圍炎癥反應不同，腦中樞具有自己的免疫系統。小膠質細胞是中樞免疫細胞，正常狀態下，“靜息”的小膠質細胞連續“監測”機體中樞神經系統，當受刺激后迅速激活，誘發炎性反應。實驗中，用紅車軸草異黃酮可一定程度抑制小膠質細胞過度激活及中樞炎癥反應，而使用GFAP和IB4石杉堿甲不能抑制小膠質細胞激活及炎癥反應，兩種藥物對術后認知影響還需進一步研究，但通過實驗我們可以推測AD與顯著減弱星形膠質細胞和小神經膠質細胞的增生有關。

綜上所述，紅車軸草異黃酮可明顯減輕Aβ1～42誘導的大鼠學習和記憶損害，初步的機制研究證實，該異黃酮能抑制NF-κB的活化、減少神經炎癥、提高突觸可塑性相關蛋白的表達、提高BDNF的水平。

4參考文獻

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〔2015-10-15修回〕

(編輯袁左鳴)

Regulative mechanism of pratensein on NF-κB signaling pathway and synaptic plasticity in cognitive impairment rats

LU Sheng-Juan,LIN Xing,LEI Dan-Qing.

Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of pratensein against cognitive impairment induced by Aβ1～42in rats.MethodsSeventy-five rats were randomly divided into five groups.Except the sham control group,all the rats in the other groups were injected bilaterally in the hippocampus with Aβ1～42peptide to establish the model of cognitive impairment.Then the rats in the treatment groups were administered orally pratensein for 3 weeks.The neuronal degeneration and neuronal apoptosis in hippocampus were detected by immunohistochemistry and TUNEL assays,respectively.The levels of NF-κB and synaptic-associated proteins were examined by Western blot.In addition,the expressions of IL-1β and TNF-α in hippocampus were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsPratensein treatment significantly ameliorated learning and memory deficits induced by Aβ1～42in rats.The further mechanism study indicated that pratensein significantly reduced the neuronal degeneration and apoptosis in hippocampus.Moreover,treatment with pratensein significantly decreased the contents of IL-1β and TNF-α,and inhibited the proliferations of astrogliosis and microgliosis in hippocampus.Pratensein could significantly suppress the activation of NF-κB in hippocampus.In addition,pratensein was able to enhance the levels of synaptophysin and brain-derived neurotrophic factor(BDNF).ConclusionsPratense can improve the learning and memory deficits induced by Aβ1～42in rats,and its mechanism may be relate to the inhibition of neuronal inflammation by suppressing NF-κB activation,and the up-regulations of synapse-related proteins and BDNF level.

【Key words】Pratensein;Cognitive impairment;NF-κB;Brain-derived neurotrophic factor;Synapsis

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81260674)；廣西自然科學基金資助項目(No.2013GXNSFAA019146)

通訊作者：雷丹青(1963-)，男，研究員，碩士生導師，主要從事天然藥物提取、分離及其應用方面的研究。

〔中圖分類號〕R74

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2318-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.004

第一作者：盧盛娟(1989-)，女，碩士，主要從事生化藥理學研究。