三種不同造模方法建立大鼠急性胰腺炎模型的對比

劉大晟　吳先林　李接興　羅羽宏

(廣東省中醫院普外科，廣東　廣州　510120)

三種不同造模方法建立大鼠急性胰腺炎模型的對比

劉大晟吳先林1李接興2羅羽宏2

(廣東省中醫院普外科，廣東廣州510120)

〔摘要〕目的采用雨蛙肽、L-精氨酸、牛磺膽酸鈉作為誘導劑建立大鼠急性胰腺炎(AP)動物模型，通過大鼠病理評分、血清生化及炎癥細胞因子指標檢測，找出一種操作簡單、重復性好的大鼠AP造模方法。方法采用不用造模方法處理后的大鼠在不同時間點采集血液及胰腺標本。檢測指標有淀粉酶(AMY)、谷丙轉氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α及胰腺組織病理評分。結果雨蛙肽組大鼠血清檢查結果及胰腺病理均符合輕型AP改變，L-精氨酸及牛磺膽酸鈉組血清檢查結果及胰腺病理均符合重癥AP改變。結論三種方法均可成模，大鼠AP模型病情最重的是牛磺膽酸鈉誘導組，其次為L-精氨酸誘導組，病情最輕為雨蛙肽誘導組。

〔關鍵詞〕急性胰腺炎；雨蛙肽；L-精氨酸；牛磺膽酸鈉

急性胰腺炎(AP)發生初期，血液中產生大量抗炎細胞因子、炎癥介質及氧自由基，炎癥介質之間相互作用，從而導致“炎癥介質瀑布樣級聯效應”〔1，2〕。炎癥介質的級聯效應失控后迅速導致SIRS，并可進一步發展為MODS。在臨床中直接進行AP的相關臨床試驗存在諸多限制，因此，學者們致力于建立AP模型進行研究其發病機制及用藥等。本實驗采用雨蛙肽腹腔注射、L-精氨酸腹腔注射、經十二指腸胰膽管逆行穿刺注射牛磺膽酸鈉等3種方法建立大鼠AP模型，觀察大鼠造模過程中血清生化指標及炎癥因子水平動態變化，結合胰腺組織石蠟切片進行病理評分，綜合評價3種大鼠AP模型嚴重程度及造模方法優劣，尋找AP的最優造模方法。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組健康雄性SPF級SD大鼠128只，采用完全隨機分組法分為空白對照組、雨蛙肽誘導組、L-精氨酸誘導組、牛磺膽酸鈉誘導組，每組32只，每組組內再根據4個時間點隨機分為4個亞組(6、12、24、48 h)，每個亞組8只。

1.2實驗動物處理空白對照組不予特殊處理。雨蛙肽誘導組：以50 μg·kg-1·h-1的誘導劑量，每隔1 h注射1次，共注射6次。L-精氨酸誘導組：采用L-精氨酸腹腔注射的方法，用配制好的20%L-精氨酸溶液腹腔注射，劑量為2.5 g/kg體重，間隔1 h注射1次，共注射2次。牛磺膽酸鈉誘導組：采用異氟烷吸入麻醉，以0.1 ml/min經十二指腸胰膽管逆行緩慢勻速注入5%牛磺膽酸鈉溶液(1 ml/kg)。

1.3實驗標本在末次處理后的第6、12、24、48小時各取8只大鼠，再以異氟烷吸入麻醉，采用心臟注射器穿刺直接采血法采集血液并處死大鼠，提取血清以檢測淀粉酶(AMY)、谷丙轉氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。取大鼠胰腺組織，固定于4%多聚甲醛溶液中備做石蠟切片。

1.4統計學分析應用SPSS16.0軟件行析因設計方差分析。

2結果

2.1大鼠血清炎癥因子結果TNF-α和IL-6在牛磺膽酸鈉誘導組和L-精氨酸誘導組都明顯升高，而IL-10則在雨蛙肽組較高。從生化結果看，三種不同造模方法均可使大鼠血清AMY明顯上升，并隨時間推移而變化。雨蛙肽誘導組大鼠ALT、BUN、Cr水平改變不明顯，說明其肝腎功能無明顯損傷，L-精氨酸誘導組大鼠血清ALT、BUN、Cr有不同程度上升，但其水平不及牛磺膽酸鈉誘導組，說明牛磺膽酸鈉誘導組AP大鼠的肝腎功能損傷更嚴重。L-精氨酸誘導組與牛磺膽酸鈉誘導組Ca2+水平在48 h均明顯下降，且與雨蛙肽誘導組相比有較明顯下降。從三組模型胰腺病理評分看，L-精氨酸誘導組與牛磺膽酸鈉誘導組病理評分峰值明顯高于雨蛙肽組，見表1～表3。

2.2胰腺石蠟切片結果空白對照組胰腺結構完整，無細胞水腫，胰管走形正常，未見小葉間間隙增寬，無出血壞死，偶見炎癥細胞。雨蛙肽誘導組胰腺細胞彌漫性水腫，小葉結構稍紊亂，可見點狀出血壞死灶，中量炎癥細胞浸潤。L-精氨酸誘導組胰腺結構紊亂，彌漫性小葉間水腫，實質出血明顯，大量炎癥細胞浸潤。牛磺膽酸鈉誘導組胰腺結構紊亂，彌漫性水腫，細胞明顯脹大，彌漫性出血壞死灶，大量炎癥細胞浸潤，見圖1。

表1　血清IL-6、IL-10、TNF-α測定結果

表2　血清AMY、ALT、BUN、Cr、Ca2+、SOD、胰腺病理評分測定結果

表3　各實驗組實驗指標析因設計方差分析

圖1　各組胰腺石蠟切片病理結果(×200)

3討論

雨蛙肽是膽囊收縮素(CCK)類似物，含有14個氨基酸殘基，可以刺激胃腸道激素分泌〔3〕。雨蛙肽誘導AP的機制是通過CCK受體，刺激胰腺腺泡，激活溶酶體酶水解組織蛋白B，導致胰蛋白酶原激活成胰蛋白酶，從而導致胰腺的“自我消化”〔4〕。雨蛙肽可以在大鼠、小鼠、兔、狗、豬等動物中成功誘發AP，且其胰腺病理變化與人類AP病理變化非常類似。1977年，Lampel等〔5〕最先將雨蛙肽用于建立大鼠AP模型，并成功建立了MAP模型。本實驗采用雨蛙肽按50 μg/kg劑量重復6次腹腔注射方法建立AP模型，結果顯示，雨蛙肽誘導組大鼠血清AMY明顯上升，并在12 h內迅速上升到較高水平，至24 h血清AMY仍維持在這一水平，與文獻相符。該組AP模型血清ALT、血清BUN、血清Cr水平上升不明顯，Ca2+水平降低程度不如另外兩個誘導組，提示該模型對肝腎功能損傷較小，病情較輕。結合IL-6、TNF-α水平提示該模型炎癥因子水平較其余兩個誘導組低，病理切片觀察胰腺壞死程度也相對較輕，因此我們認為雨蛙肽腹腔注射法建立的AP模型為MAP。

L-精氨酸大劑量腹腔注射法建立大鼠AP模型最早由Mizunuma等〔6〕報道，隨后該模型被廣泛應用。目前機制尚不清楚，可能與L-精氨酸誘導產生氧自由基、一氧化氮或釋放炎癥介質有關〔7，8〕。現已證實，L-精氨酸在一氧化氮合成酶(NoS)催化下生成一氧化氮(NO)〔9〕。L-精氨酸在AP中有雙重作用，在生理劑量時L-精氨酸及其代謝產物NO可以維持各系統功能，改善胰腺微循環，防止血栓形成，對AP起到保護及減輕胰腺損傷的作用〔10〕。另一方面，當大劑量給予L-精氨酸時在機體產生大量NO，NO作為自由基也可以對細胞產生損傷，促使AP的發生及加重其病情〔11〕。本實驗采用20%L-精氨酸按2.5 g/kg分兩次腹腔注射，結果顯示L-精氨酸腹腔注射后血清AMY水平迅速上升，在24 h達到峰值，在48 h有所下降。病理切片結果顯示在24 h胰腺組織出血壞死明顯，大量炎癥細胞浸潤，符合SAP診斷。另外，該模型血清ALT、血清BUN、血清Cr水平升高，提示有肝腎功能損害，結合血清IL-6、TNF-α上升明顯，說明該模型為SAP模型。實驗結果顯示，在12～24 h檢測點檢測生化指標及炎癥因子水平為最嚴重，但48 h時均有不同程度好轉，據此我們認為，該模型胰腺組織發生壞死在造模后24 h最嚴重，隨后可能有自愈傾向。

牛磺膽酸鈉經胰膽管逆行注射法造模是常用的經典造模方法之一〔12〕。牛磺膽酸鈉是兩種膽汁酸的主要成分之一，該造模方式模擬膽總管下段梗阻時膽汁反流入胰膽管時引起的AP，而膽源性AP在臨床中占總病例數的大部分，因此該模型在研究AP時較為廣泛應用。本實驗采用5%牛磺膽酸鈉經胰膽管逆行注射的方法建立AP模型，實驗結果顯示造模后6 h血清AMY就迅速上升，并能達到較高水平。血清生化如ALT、BUN、Cr等指標有明顯改變，血清Ca2+、SOD水平下降明顯，血清IL-6、IL-10、TNF-α水平較空白對照組有明顯改變，說明牛磺膽酸鈉建立AP模型病情嚴重，可導致MODS。胰腺病理切片可觀察到胰腺組織出血壞死明顯，大量炎癥細胞浸潤，是典型SAP征象。

雨蛙肽方法建立的AP模型病情相對較輕，簡單、無創，重復性好，是建立輕型大鼠AP模型的理想方法。L-精氨酸按方法同樣具有簡單、無創、重復性好等優點。牛磺膽酸鈉經十二指腸胰膽管逆行穿刺方法可以成功快速建立大鼠AP模型，且建立的AP模型病情重，血清生化指標及炎癥因子等改變明顯，是建立合并有器官功能損傷的SAP模型理想的方法。綜上，在相同時間點分析3種建立AP模型方法，大鼠AP模型病情最重的是牛磺膽酸鈉誘導組，其次為L-精氨酸誘導組，病情最輕為雨蛙肽誘導組。

4參考文獻

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〔2015-12-03修回〕

(編輯李相軍)

Comparative study in acute pancreatitis rat models induced by three different methods

LIU Da-Sheng，WU Xian-Lin，LI Jie-Xing，et al.

Department of General Surgery,the Hospital of Guangdong of TCM,Guangzhou 510120,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo find out a simple and reproducible methods of acute pancreatitis(AP)model rat.MethodsRats were received different methods to set up AP rat models.Serum biochemical indicators and pancreas specimens of the four groups rats were tested after AP induction.The levels of AMY,ALT,BUN,Cr,Ca2+,SOD,IL-6,IL-10,TNF-α were detected,and pathological scores of pancreas tissues were measured.ResultsSerum indicators and pathological score of caerulein group were in line with mild AP,yet those of L-arginine and sodium taurocholate group were in line with severe AP.ConclusionsThe models of AP rat could be established successfully by the three ways，the model induced by sodium taurocholate was the most serious illness and the caerulein was the lightest condition according to the three experimental groups at the same time point.

【Key words】Acute pancreatitis;Caerulein;L-arginine;Sodium taurocholate

基金項目：國家自然科學基金資助(No.81403302)；廣東省自然科學基金資助(2014A030310477)；中央高校基本科研業務費專項資金資助(No.21614306)

通訊作者：羅羽宏(1963-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事普外科疾病的診治研究。

〔中圖分類號〕R57

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2315-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.003

1暨南大學附屬第一醫院中西醫結合胰腺病診治中心

2暨南大學附屬第一醫院肝膽外科

第一作者：劉大晟(1989-)，男，碩士，醫師，主要從事普外科疾病的診治研究。