CXCL8/PI3K-Akt信號通路在缺氧誘導的人腦膠質瘤細胞血管生成擬態中的作用

安芳玲　和禎泉　馬　芳　扈一楠　顧金海

(寧夏醫科大學寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏　銀川　750004)

CXCL8/PI3K-Akt信號通路在缺氧誘導的人腦膠質瘤細胞血管生成擬態中的作用

安芳玲和禎泉馬芳扈一楠顧金海

(寧夏醫科大學寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏銀川750004)

〔摘要〕目的探討CXCL8/PI3K-Akt信號轉導通路在缺氧誘導的人腦膠質瘤細胞株U87MG和U251血管生成擬態中的作用。方法用氯化鈷(CoCl2)模擬缺氧環境，將人腦膠質瘤細胞株U87MG和U251置中培養。分別加入PI3K-Akt信號通路激動劑CXCL8及PI3K-Akt信號通路抑制劑LY294002干預48 h，體外成管實驗檢測各組細胞成管能力；Western印跡檢測各組Akt、P-Akt蛋白的表達情況。結果缺氧可導致U87MG細胞和U251細胞形成的管腔樣結構明顯增加，Akt蛋白的磷酸化活化表達顯著增加(P<0.05)。加入CXCL8干預可使管腔樣結構直徑進一步增長，而加入LY294002干預48 h則可使其管腔樣結構在數量和直徑上顯著少于缺氧組(P<0.05)。CXCL8能夠有效激活Akt磷酸化，LY294002則顯著抑制其磷酸化活化(P<0.05)，而總Akt蛋白表達無差異(P>0.05)。結論CXCL8/PI3K-Akt信號轉導通路在缺氧誘導的人腦膠質瘤細胞株U87MG和U251血管生成擬態中發揮重要的促進作用，可望成為膠質瘤治療有效靶點。

〔關鍵詞〕人腦膠質瘤；血管形成擬態；CXCL8；PI3K-Akt

血管生成擬態(VM)作為一種不依賴于血管內皮細胞的腫瘤內管狀網絡模式，為抗腫瘤血管治療提供了新的思路〔1〕。研究表明，缺氧是實體瘤微環境的最基本的特征之一，是由于腫瘤內血管結構和功能異常而導致的腫瘤細胞血供、氧供減少，以及腫瘤細胞的快速增殖而導致的腫瘤細胞氧耗增加〔2～4〕。這種狀態可以改變腫瘤的生物學特性，導致腫瘤細胞的遺傳不穩定性和侵襲力增加，以及對放化療的抵抗性增強。血管內皮生長因子(VEGF)是促進血管生成的主要因子，其產生受缺氧誘導〔5〕。在缺氧條件下VEGF能夠促進VM的網絡狀結構的形成。磷脂酰肌醇-3激酶/絲-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號轉導通路的活化廣泛存在于各種類型的細胞中，并且在腫瘤細胞周期調控、增殖和分化等多種生命活動中起著至關重要的作用。本研究旨在以膠質瘤細胞系U87MG、U251為實驗對象，氯化鈷(CoCl2)模擬體外缺氧〔6〕，驗證缺氧對膠質瘤細胞生物學特性的影響，并且研究其相關機制。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑人腦膠質瘤細胞U87MG、U251均購于上海市吉凱基因化學技術有限公司。DMEM培養基購自美國HyClone公司。人CXCL8購自美國Pepro Tech公司。PI3K通路特異性抑制劑 LY294002和二甲基亞砜(DMSO)均購自美國 Sigma 公司；兔抗人Akt(pan)(11E7)和Phospho-Akt(Thr308)/(244F9)單克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司，兔抗人GAPDH多克隆抗體(AB-P-R OO1)購自杭州賢至生物科技有限公司，熒光二抗Goat anti-Rabbit 926-32211購自美國li-cor公司。Western印跡相關試劑均購自南京凱基生物科技發展有限公司。BD基質膠購自美國Sigma公司，Transwell 小室購于美國Corning 公司。鈣黃綠素購自AAt bioquest。

1.2方法

1.2.1細胞培養采用含有10%胎牛血清、1%氨芐青霉素和鏈霉素的DMEM培養基培養人膠質瘤細胞U87MG和U251，置于37℃，體積分數為5% CO2培養箱內進行常規培養，取對數生長期細胞進行實驗，CoCl2用無菌三蒸水配成濃度為50 mmol/L的母液，過濾后分裝，避光保存于-20℃，使用前用培養基稀釋成所需濃度的CoCl2工作液。實驗分為對照組，缺氧組(培養基中加入 CoCl250 mm/L)，缺氧組加入外源性CXCL8(50 ng/ml)，缺氧組加入抑制劑LY294002(50 μmol/L)。U251細胞的處理方法相同。各組細胞分別接種培養48 h后，進行各指標檢測。

1.2.2膠質瘤細胞體外擬血管形態觀察BD基質膠在冰水浴中過夜融化，用預冷的槍頭吸取 50 μl Matrigel加入到水平放置在冰盒上的96孔板內，均勻鋪平后將96孔板放入37℃培養箱內孵育1 h使膠凝固。用胰蛋白酶消化U87MG和U251細胞，離心，棄上清后用DMEM重懸，調整細胞終濃度為1×104個/孔接種于預先鋪好Matrigel的96孔板內，每孔100 μl，放置細胞培養箱內。12 h后觀察各組處理細胞能否在凝膠上形成網狀結構。

1.2.3Western印跡檢測U87MG和U251細胞在6孔培養板中培養，至70%～80%匯合率時，提蛋白進行Western印跡實驗。48 h后拿出培養的各組細胞，用冷PBS洗2次，加入配好的細胞裂解液(全過程在冰上操作)，置于4℃搖床充分裂解15 min，然后用細胞刮子刮下細胞，吸入到1.5 ml EP管，15 000 r/min，離心15 min，吸取上清即為所需全蛋白，-80℃保存。用來實驗的蛋白用BCA法測定蛋白濃度，煮蛋白98℃ 5 min。然后取蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜，用TBST配制的牛奶封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜(Akt，P-Akt，GAPDH稀釋比分別為1∶500，1∶2 000，1∶3 000)。過夜后用TBST洗膜5次，每次5 min，之后用熒光二抗(1∶5 000)避光室溫孵育1 h，TBST洗膜5次后用奧德賽(ODYSSEY CLx)曝光。掃描灰度并計算蛋白相應的表達量。

1.3統計學分析采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2結果

2.1缺氧對膠質瘤細胞VM的影響經Calcein 染色，鏡下觀察，對照組常氧條件下U87MG細胞生長序列紊亂，無明顯規律，但能發現少數的網狀結構；缺氧組細胞相互連接，融合形成網狀結構，呈單個環或多個環連接的網絡樣結構。對照組管腔結構的長度為(45.113±2.721)μm，而缺氧組為(200.161±2.148)μm，組間比較差異顯著(P<0.05)。U251細胞顯示出相似的結果，對照組管腔結構的長度為(45.113±2.721)μm，而缺氧組為(110.315±2.633)μm，組間比較差異顯著(P<0.05)。見圖1，圖2。

2.2激動劑CXCL8對膠質瘤細胞體外VM的增強作用當缺氧組加入激動劑CXCL8(50 ng/ml)后，表現為更多細胞之間互相融合，連接成網狀結構，形成管腔樣結構，對照組管腔結構的長度為(45.113±2.721)μm，而缺氧加CXCL8組為(157.206±1.993)μm，組間比較差異顯著(P<0.05)。U251細胞顯示出相似的結果，對照組管腔結構的長度為(45.113±2.721)μm，而缺氧加CXCL8組為(88.075±1.997)μm，組間比較差異顯著(P<0.05)。結果說明CXCL8能夠增強膠質瘤細胞體外VM的現象。見圖1，圖2。

2.3抑制劑LY294002對膠質瘤細胞體外血管生成擬態的抑制作用當缺氧組加入抑制劑LY294002(50 μmol/L)后，細胞管腔樣結構減少，呈無序列紊亂生長。對照組管腔結構的長度為(45.113±2.721)μm，而缺氧加LY294002組為(244.763±2.011)μm，組間比較差異顯著(P<0.05)。U251細胞顯示出相似的結果，對照組管腔結構的長度為(45.113±2.721)μm，而缺氧加LY294002組為(206.673±1.780)μm，組間比較差異顯著(P<0.05)。結果說明LY294002能夠抑制膠質瘤細胞體外血管生成擬態的現象。見圖1，圖2。

A：對照組；B：缺氧組；C：缺氧+CXCL8組；D：缺氧+LY294002組；下圖同圖1　膠質瘤細胞U87MG擬血管形態形成檢測(×100)

圖2　膠質瘤細胞U251擬血管形態形成檢測(×100)

2.4缺氧對P-Akt表達情況的影響Western印跡結果顯示，CoCl2處理的缺氧組與對照組比較，Akt的表達無顯著差異(P>0.05)，而P-Akt的表達明顯高于對照組(P<0.05)。U251細胞顯示出相似的結果。結果說明缺氧能夠使得膠質瘤細胞P-Akt表達增加。見圖3。

2.5抑制劑LY294002和激動劑CXCL8分別對P-Akt表達的影響Western印跡結果顯示，當缺氧組加入CXCL8后，相比缺氧組，Akt的表達無顯著差異(P>0.05)，而P-Akt表達明顯增強(P<0.05)。而缺氧組加入LY294002后，相比缺氧組，Akt的表達無顯著差異(P>0.05)，而P-Akt表達降低(P<0.05)。U251細胞也表現出相似的結果。結果說明，當加入CXCL8后，P-Akt的表達增加，CXCL8對膠質瘤細胞VM的生成有促進作用，而即LY294002對膠質瘤細胞VM有減弱作用。見圖3。

圖3　Western印跡檢測膠質瘤細胞U87MG和U251中P-Akt的表達

3討論

VM 由于沒有內皮細胞的屏障作用，不但可以為腫瘤的生長提供良好的血液灌注，且有利于腫瘤細胞的轉移〔7～9〕。VEGF能夠促使血管內皮細胞有絲分裂并最終形成新生血管，更是刺激腫瘤血管生成的最強的細胞因子。本實驗在鋪有BD基質膠的培養板上培養，它有利于膠質瘤細胞形成毛細血管管腔樣結構；其次，這個過程要有促血管生成因子的存在，這就必須有促進膠質瘤細胞分泌某些因子或添加血管生長因子。鈷通過細胞內離子置換使亞鐵螯合酶失活，從而達到抑制細胞對氧的利用，最終達到常氧下誘導細胞缺氧的效果。缺氧會誘導膠質瘤細胞分泌一些生長因子包括 VEGF、HGF、IGF 等對抗凋亡，其中以VEGF最重要。惡性膠質瘤是中樞神經系統中最常見的VEGF高表達并且富含大量新生血管的腦腫瘤〔10〕。VEGF不僅可以對膠質瘤細胞的凋亡起到對抗作用〔11〕。VEGF的高表達與腫瘤擬形成的微血管密度、惡性程度以及患者的預后不良等有著密切的關系〔12〕。

近期研究顯示，VEGF在神經系統中的作用是由包括PI3K依賴活化的絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶、Akt(又名PKB)在內的抗凋亡途徑介導〔13〕。PI3K和PI3K/Akt信號通道能夠被一些神經營養因子和其他的生物學刺激而激活〔14〕，它涉及轉錄、細胞凋亡、增殖、遷移和血管發生等多種過程〔15〕。CXCL8介導的Ser/Thr蛋白激酶Akt作為PI3K/Akt信號通路的重要靶點，在多種惡性腫瘤中均可發現其異常活化。因此，通過調節Akt表達可以調整膠質瘤細胞擬血管形態形成的平衡，從而達到抑制腫瘤生長及侵襲等的目的。LY294002 能夠顯著地抑制 Akt的磷酸化，是PI3K-Akt 信號傳導通路的特異性抑制劑。由于LY294002的分子量小，能夠輕易地穿過血腦屏障，目前已經成為該通路在膠質瘤發生發展中作用機制的研究熱點〔16〕。

本實驗發現，缺氧造成VEGF的高表達，VEGF又通過一種信號途徑使得P-Akt 的表達量增加。因為CXCL8能夠直接作用于PI3K-Akt信號通路，使得Akt磷酸化，因此，在缺氧組加入激動劑CXCL8后，膠質瘤細胞擬血管形態的形成能力升高，而P-Akt的表達也較缺氧組增加，說明CXCL8在擬血管形態形成的過程中起著一定的作用。同時，我們在缺氧組加入了PI3K-Akt信號通路的抑制劑LY294002，結果發現膠質瘤細胞擬血管形態能力減弱，P-Akt的表達量也降低。因此我們推測，VM形成可能是腫瘤生長過程中應對缺氧等刺激因素的一種方式。快速生長的腫瘤需要氧供，缺氧促使有可塑性的腫瘤細胞互相連接，形成擬態血管，給腫瘤組織供氧，腫瘤細胞高表達的 VEGF可能在這種細胞自身變形形成擬態血管過程中起一定促進作用，即腫瘤早期從擬態血管獲得血供，生長加速，高表達的 VEGF進一步促新生血管形成，而且由于其結構特殊性使腫瘤細胞與血流之間的屏障減弱，腫瘤細胞進入血液循環的可能性加大，增高轉移概率，符合臨床研究得出的存在VM的腫瘤患者病情進展快、轉移早、愈后差的結論。而其機制可能是缺氧導致VEGF的表達量增加，過表達的VEGF刺激膠質瘤細胞分泌CXCL8，從而激活PI3K-Akt信號通路，使得膠質瘤細胞擬血管形態能力增加，這或許是膠質瘤細胞擬血管形態形成的原因之一。

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〔2015-12-03修回〕

(編輯徐杰)

Roles of CXCL8/PI3K-Akt signaling pathway in vascular mimicry induced by hypoxia of human glioma cell line U87MG and U251

AN Fang-Ling，HE Zhen-Quan，MA Fang,et al.

Ningxia Key Laboratory of Cerebrocranial Diseases，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia,China

【Abstract】ObjectiveTo study the roles of CXCL8/PI3K-Akt signaling pathway in vascular mimicry induced by hypoxia of human glioma cell.MethodsThe chemical hypoxia was induced by incubation of U87MG cells and U251 cell with cobalt chloride.After the two cells were treated with CXCL8(the activator of PI3K/Akt)and LY294002(the inhibitor of PI3K/Akt)for 48 h，the tube formation of tumor cells were tested by transwell chamber test and vascular mimicry experiment.Western blot assay was employed to determine the expressions of Akt and p-Akt.ResultsThe formed tubes of U87MG cells and U251 cells were significantly increased by incubated with cobalt chloride,either did the expression level of p-Akt.Compared to hypoxia group，there were more formed tubes after CXCL8 treatment,while less formed tubes after LY294002 treatment.Western blot indicated that the expression of p-Akt at protein level was decreased(P<0.05)，while STAT3 protein had no difference among each group(P>0.05).ConclusionsCXCL8/PI3K-Akt signaling pathway plays an important roles in vascular mimicry induced by hypoxia of human glioma cells in vitro，so it could be expected as a potential target for the treatment of glioma.

【Key words】Glioma;Vascular mimicry;CXCL8;PI3K-Akt

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81160312)；寧夏醫科大學校級科研項目(XM201314)

通訊作者：顧金海(1974-)，男，博士后，副教授，碩士生導師，主要從事顱腦疾病及信號通路的研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2312-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.002

第一作者：安芳玲(1990-)，女，碩士，主要從事人腦膠質瘤信號通路研究。