丹紅注射液改善糖尿病小鼠下肢缺血血管新生的研究

張爭艷，王　鵬，伍　鋒，吳宗貴

丹紅注射液改善糖尿病小鼠下肢缺血血管新生的研究

張爭艷，王鵬，伍鋒，吳宗貴

中國人民解放軍第二軍醫大學附屬長征醫院(上海200003)

摘要：目的 觀察丹紅注射液對糖尿病小鼠下肢缺血后血管新生的影響。方法 40只Balb/c小鼠，其中10只為正常對照組，30只采用鏈脲霉素腹腔注射聯合左下肢股動脈結扎分離術制備糖尿病下肢缺血模型。模型小鼠中隨機選取10只腹腔注射PBS作為Control組，10只腹腔注射丹紅注射液作為DH組(2 μL/g，連續注射7 d)。采用激光多普勒血流灌注掃描儀觀察血流灌注情況、動脈X線造影觀察血管管樣新生情況，及采集下肢肌肉組織勻漿，通過ELISA檢測血管內皮生長因子(VEGF)表達量。 結果 與PBS對照組相比，丹紅注射液顯著增加糖尿病小鼠下肢缺血血流灌注、管樣新生，并提高硫化氫濃度，VEGF表達量顯著增高(P<0.05)。結論丹紅注射液能改善糖尿病小鼠下肢缺血的血管新生，其可能機制是通過VEGF信號通路發揮作用。

關鍵詞：糖尿病；下肢缺血；血管新生；丹紅注射液；小鼠；血管內皮生長因子

中醫“生脈”理論與治療性血管新生密切相關，歷代文獻中均有“生脈”“生血”“生肌”等方面的論述。中醫藥能夠作用于疾病發生的不同環節，不同階段，多重功效相結合，從而達到促進血管新生的作用，這為缺血性心血管病的中醫藥研究提供了新的途徑。丹紅注射液(Danhong Injection，DH)為丹參、紅花提取物按科學配方制備的中藥復方制劑，指紋圖譜結果顯示其主要成分為多種丹參酮、丹參酸、紅花黃素、紅花酮苷等，具有活血化瘀、通脈舒絡的功效，在臨床上主要用于治療心腦血管等缺血性疾病。研究表明，丹紅注射液具有抗氧化、預防血栓形成、擴張血管、改善缺血再灌注損傷等功效[1-4]。

血管新生的起始步驟是血管萌芽，血管內皮生長因子(VEGF)與其受體VEGFR-2結合能夠刺激頂端細胞動員并伸出絲狀偽足，阻斷VEGFR-2，血管萌芽過程明顯抑制[5]。相反，VEGFR-1抑制后，能顯著增加血管萌芽和管樣形成，Chappell與其同事根據這一實驗結果，猜測VEGFR-1在防止過度血管生成中發揮著重要生物學作用[6-7]。VEGF在血管新生中的重要作用毋庸置疑，VEGF的變化也被認為是藥物干預血管新生的重要評估指標。治療性血管新生為缺血性心臟病病人提供了一種嶄新、有效的治療方法，血管新生是一個涉及多因素、多環節的復雜過程。本研究旨在探索丹紅注射液對糖尿病小鼠下肢缺血后血管新生的影響及可能機制。

1材料與方法

1.1試劑與藥物丹紅注射液：由菏澤步長制藥有限公司提供，生產批號：國藥準字Z20026866；鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)購于美國Sigma-aldrich公司；1%戊巴比妥鈉溶液購于德國Merck公司；0.1%mol/L檸檬酸緩沖液粉劑購于國藥集團化學試劑有限公司上海分公司；Omnipaque造影劑：美國Amersham公司產品。mBBr (Monobromobimane)：貨號M1813，美國Sigma公司產品；Sulfosalicylic acid；貨號S2130，美國Sigma公司產品。

1.2儀器PIM 3 激光多普勒血流灌注成像儀：瑞典PERIMED公司產品；櫥柜式小動物X光成像系統：MX-20，美國Faxitron公司產品；Waters2695高效液相色譜儀：美國Waters公司產品；Waters474熒光檢測儀：美國Waters公司產品。

1.3動物飼養及分組40只Balb/c小鼠均于中國科學院上海藥物研究所SPF級動物房分籠飼養，每5只一籠。所有的動物實驗及手術方式符合中國科學院上海藥物研究所動物使用與管理委員會的標準。中國科學院上海藥物研究所SPF級動物房內換氣次數(8～15)次/小時，氨濃度≤20 ppm，相對濕度40%～80%，濾過后空氣為萬級，溫度(20～24)℃。40只小鼠隨機分為4組，每組10只。Ⅰ組為單純糖尿病對照組；Ⅱ組為糖尿病后肢缺血；Ⅲ組為糖尿病后肢缺血+PBS(2 μL/g×7 d，腹腔注射)組；Ⅳ組為糖尿病后肢缺血+DH(2 μL/g×7 d，腹腔注射)組。

1.4糖尿病小鼠下肢缺血模型制備小鼠飼養1周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ 150 mg/kg。糖尿病小鼠造模成功標準：出現多飲、多尿、多食及體重下降等糖尿病癥狀，連續2次隨機血糖≥16 mmol/L。后于體視顯微鏡下，仔細分離出股動脈、旋髂外動脈、股動脈肌支和大隱動脈，用3/0號線結扎股動脈，留線頭；其膝關節內側，分離股動脈，用3/0號線結扎。將股動脈、股靜脈和股神經分離開，抽剝兩結扎點之間的股動脈，用細線縫合肌層和皮膚。制備糖尿病下肢缺血模型。術后觀察肢體缺血情況，用以下評估參考分值來判斷：膚色、皮溫未發生明顯改變計0分；壞死局限于腳趾計1分；壞死局限于足背計2分；壞死局限于小腿計3分；壞死范圍波及大腿以上計4分。

1.5檢測指標及方法

1.5.1激光多普勒血流灌注成像掃描評估下肢血流灌注情況第4周為實驗終點。掃描前，用1%戊巴比妥鈉 120 μL/20 g腹腔麻醉，雙下肢呈“L”型。灌注比色刻度尺調整為0～400，掃描靈敏度調整為0.25，掃描小鼠腹部、下肢和尾部上端。采用LDPIwin 3.0軟件分析血流灌注情況。

1.5.2X線動脈血管造影采用美國Faxitron櫥柜式小動物X光成像系統MX-20進行X線動脈造影。抽取5 mL歐乃派克(Omnipaque)造影劑，將注射器插入左心室，快速推注造影劑。可見腹主動脈變白，拭去溢出的造影劑，置于櫥柜式小動物X光成像儀中，進行X線掃描。掃描圖片，選取髖關節到踝關節處整個后肢肌肉區域，采用Image J軟件計算手術側與非手術側動脈造影評分(angiographic score)比率，評估血管側支形成情況。

1.5.3下肢組織勻漿液抽提RNA檢測VEGF mRNA和蛋白表達量采用Real-Time PCR測定組織中VEGF mRNA表達量。提取出的基因組DNA為模板，SYBR Green I為熒光標記物，進行實時定量PCR測定。以GAPDH為內參照，檢測VEGF的相對表達量。擴增后目的基因相對表達量=2-(Cytokine Ct -GAPDH Ct)。公式內Cytokine系指目的基因，循環閾值Ct(cycle threshold)為目的基因cDNA達到指數擴增時的循環數。采用VEGF的ELISA試劑盒檢測下肢組織勻漿中VEGF的量。

2結果

2.1糖尿病小鼠下肢缺血模型制備和鑒定40只小鼠均一次性腹腔注射STZ 150 mg/kg，成功率為100%，各組間血糖值無明顯差異，各時間點測得血糖不作重復測量資料的方差分析(見表1)。手術后采用激光多普勒觀察后肢缺血情況，顯示相比于假手術側，手術側血流灌注明顯下降(見圖1)。

表1　各組隨機血糖動態變化情況比較(±s) 　 mmol/L

注：1為手術側(左側)，2為假手術側(右側)；左側為空白對照組，右側為后肢缺血手術組。

2.2小鼠體重及手術側下肢缺血情況的變化初始體重4組小鼠差別無統計學意義，實驗期間體重隨著時間的延伸呈規律性的變化，各時間點測得體重不作重復測量資料的方差分析(見表2)。將小鼠分為兩組，A組為下肢缺血非糖尿病對照組(于實驗第2周結扎下肢股動脈)；B組為糖尿病下肢缺血組(實驗第0周STZ腹腔注射制備糖尿病模型，第2周結扎下肢股動脈)，結果顯示糖尿病顯著抑制下肢缺血后血流灌注的恢復(見表3)。

表2　各組小鼠體重動態變化情況(±s) 　 g

表3　各組激光多普勒血流掃描比值

2.3下肢缺血血管新生觀察在糖尿病小鼠下肢缺血模型上觀察到，與PBS對照組相比，DH能提高糖尿病下肢缺血后血流灌注、管樣新生和微血管新生，差異具有統計學意義(P<0.05，見表4)。注射STZ后第3天，小鼠表現出多飲、多食、多尿等癥狀。下肢缺血模型完成后第1周(實驗第3周)，4組小鼠下肢手術側均出現不同程度干性壞疽，其后出現不同層面的肢體離斷，以足趾及下肢遠端離斷最為常見，等級資料的多個樣本非參數檢驗結果顯示，各組手術側下肢缺血情況變化有差異(見表5)。

表4　各組干預后小鼠手術側下肢缺血后血管新生情況(±s) 　 %

表5　各組第4周小鼠手術側下肢缺血情況以及功能評估　只

2.4VEGF信號通路作用與PBS對照組相比，DH能提高糖尿病下肢缺血后局部VEGF的mRNA和蛋白水平表達量，差異具有統計學意義(P<0.05)。 詳見表6。

表6　各組干預后VEGF的mRNA和蛋白比較(±s)

3討論

缺血性疾病是一種進展性的疾病，25%病人最終需要進行血運重建治療，5%～10%病人可能發展為重癥下肢缺血(critical limb ischemia，CLI)[8]。當缺血性疾病合并糖尿病時，CLI發病率明顯增高，由于這種類型的CLI治療手段有限，主要是外科手術、藥物治療，給社會和家庭帶來沉重的負擔[9-11]。外科手術雖然短期療效立竿見影，在很長的一段時間被認為是治療此類疾病最經典的方法，但是其長期并發癥多，部分病人只能面臨嚴重缺血導致的截肢，最終影響病人的生活質量，尤其是當病人伴有糖尿病時，手術療效相對較差[12]。藥物治療起效慢，效果不甚顯著。糖尿病狀態下，高糖誘發的多種有害因素刺激，使機體蛋白質、脂類和核酸，在非酶促的條件下，形成結構穩定和不可逆的AGEs，使許多組織和血漿蛋白的結構和功能發生改變造成組織損傷和功能障礙，最終影響藥物療效[13-15]。本研究也證實，缺血性疾病合并糖尿病，內源性血管新生修復機制障礙。隨著干細胞研究的逐漸深入，以干細胞為基礎的治療性血管新生越來越受到重視，干細胞移植到CLI病人機體，促進缺血組織血管新生，改善組織血液灌注，恢復其功能被認為是CLI又一新的治療策略[16-19]。

VEGF的蛋白和基因治療相關研究最為成熟，許多成果也已經應用于CLI治療的臨床前期。Lathi等[20]的Ⅰ期臨床實驗對69例CCS(3～4)級的難治性心絞痛病人進行裸VEGF-165 DNA基因治療，SPECT可測得不管是在靜息還是心肌負荷條件下，心肌灌注均有增加。提示基因治療可以恢復或促進血管新生，增強心肌收縮力，使病人心絞痛癥狀有明顯改善，心絞痛發作次數和硝酸甘油用量明顯減少。然而，無論是VEGF蛋白及基因治療，還是最新的細胞治療技術，都存在明顯的臨床應用局限性。VEGF可能加速粥樣斑塊內血管生成導致斑塊的擴張或破裂[21]，或通過刺激成纖維細胞及血管中層平滑肌細胞增生而促進冠狀動脈狹窄的發展[22]。大劑量VEGF還可導致貧血、血小板減少、膜性腎病，最終誘發腫瘤、糖尿病性視網膜病變加重[23]。基因治療中，裸DNA及非病毒載體轉染效率低，持續時間短，而病毒載體則轉染效率高，但存在激發異常免疫反應的危險。細胞治療同樣也存在一些問題，如采集骨髓步驟煩瑣、需要骨髓量較大，由細胞移植引起細胞因子的釋放從而導致心肌的損傷、心肌內腫瘤形成等。

中醫藥具有多靶點干預的特點，使其在促進治療性血管新生臨床轉化中具有潛在的優勢。中西醫結合促進心血管病治療性血管新生相關研究最為成功的中藥，莫過于麝香保心丸。研究表明，丹參和紅花配伍能夠改善缺血后氧化應激和炎癥浸潤，具有改善缺血后組織壞死的功效[24-25]。丹參為雙子葉植物唇形科，干燥根及根莖入藥，其味苦，性微寒，歸心、肝二經，具有活血調經，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養血安神之功效，是常用的活血化瘀中藥，有效成分主要為脂溶性丹參酮類和水溶性苯酚酸類等。在雞胚絨毛尿囊(chick chorioallantoic membrane，CAM)模型上，驗證了丹紅注射液具有促進血管新生的作用，其機制可能與促進VEGF分泌有關[26]。也有研究表明，丹紅注射液能夠改善腦缺血，抑制缺血再灌注后神經元的凋亡[3]，亦能促進心肌缺血后血流再灌，并且抑制再灌注誘導的心肌凋亡[27]。丹參和紅花的配伍，單獨使用就有可能取得促進缺血后血管新生的療效，但是糖尿病后肢缺血的病人機體內源性修復功能極其微弱，單獨輔以中醫藥治療，只能緩解短期癥狀，難以改善病人的遠期預后。

本研究結果顯示，丹紅注射液能夠顯著促進CLI的血管新生，改善病人預后。

參考文獻：

[1]智曉文，蘇顯明，封衛毅，等.丹紅注射液對大鼠離體腸系膜動脈血管環作用及機制[J].中國中藥雜志，2012，37(17)：2607-2611.

[2]Liu HT，Wang YF，Olaleye O，et al.Characterization of in vivo antioxidant constituents and dual-standard quality assessment of danhong injection[J].Biomed Chromatogr，2013，27(5)：655-663.

[3]He Y，Wan H，Du Y，et al.Protective effect of danhong injection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].J Ethnopharmacol，2012，144(2)：387-394.

[4]Liu H，Wang S，Sun A，et al.Danhong inhibits oxidized low-density lipoprotein-induced immune maturation of dentritic cells via a peroxisome proliferator activated receptor gamma-mediated pathway[J].J Pharmacol Sci，2012，119(1)：1-9.

[5]Phng LK，Gerhardt H.Angiogenesis：a team effort coordinated by notch[J].Dev Cell，2009，16(2)：196-208.

[6]Chappell JC，Bautch VL.Vascular development：genetic mechanisms and links to vascular disease[J].Curr Top Dev Biol，2010，90：43-72.

[7]Jakobsson L，Franco CA，Bentley K，et al.Endothelial cells dynamically compete for the tip cell position during angiogenic sprouting[J].Nat Cell Biol，2010，12(10)：943-953.

[8]Maione C，Botti C，Coppola CA，et al.Effect of autologous transplantation of bone marrow cells concentrated with the marrowxpress system in patients with critical limb ischemia[J].Transplant Proc，2013，45(1)：402-406.

[9]Liang KW，Kuo HN，Lee WL，et al.Different mid-term prognostic predictors of major adverse events in diabetic and nondiabetic peripheral artery disease presenting with critical limb ischemia[J].Angiology，2016，37(3)：287-291.

[10]Liistro F，Angioli P，Grotti S，et al.Impact of critical limb ischemia on long-term cardiac mortality in diabetic patients undergoing percutaneous coronary revascularization[J].Diabetes Care，2013，36(6)：1495-1500.

[11]Li GF，Luo HK，Li LF，et al.Dual effects of hydrogen sulphide on focal cerebral ischaemic injury via modulation of oxidative stress-induced apoptosis[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2012，39(9)：765-771.

[12]Wallaert JB，Nolan BW，Adams J，et al.The impact of diabetes on postoperative outcomes following lower-extremity bypass surgery[J].Vasc Surg，2012，56(5)：1317-1323.

[13]Kovacic P，Somanathan R.Cell signaling and receptors in toxicity of advanced glycation end products (ages)：alpha-dicarbonyls，radicals，oxidative stress and antioxidants[J].J Recept Signal Transduct Res，2011，31(5)：332-339.

[14]Yap FY， Kantharidis P，Coughlan MT，et al.Advanced glycation end products as environmental risk factors for the development of type 1 diabetes[J].Curr Drug Targets，2012，13(4)：526-540.

[15]Prasad A，Bekker P，Tsimikas S.Advanced glycation end products and diabetic cardiovascular disease[J].Cardiol Rev，2012，20(4)：177-183.

[16]Yin J，Tu C，Zhao J，et al.Exogenous hydrogen sulfide protects against global cerebral ischemia/reperfusion injury via its anti-oxidative，anti-inflammatory and anti-apoptotic effects in rats[J].Brain Res，2013，1491：188-196.

[17]Huang YE，Tang ZH，Xie W，et al.Endogenous hydrogen sulfide mediates the cardioprotection induced by ischemic postconditioning in the early reperfusion phase[J].Exp Ther Med，2012，4(6)：1117-1123.

[18]Liew A，O’Brien T.Therapeutic potential for mesenchymal stem cell transplantation in critical limb ischemia[J].Stem Cell Res Ther，2012，3(4)：28.

[19]Mamidi MK， Pal R，Dey S，et al.Cell therapy in critical limb ischemia：current developments and future progress[J].Cytotherapy，2012，14(8)：902-916.

[20]Lathi KG， Vale PR，Losordo DW，et al.Gene therapy with vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease：anesthetic management and results[J].Anesth Analg，2001，92(1)：19-25.

[21]Moreno PR，Purushothaman M，Purushothaman KR.Plaque neovascularization：defense mechanisms，betrayal，or a war in progress[J].Ann N Y Acad Sci，2012，1254：7-17.

[22]Chanakira A， Dutta R，Charboneau R，et al.Hypoxia differentially regulates arterial and venous smooth muscle cell proliferation via PDGFR-beta and VDGFR-2 expression[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，302(5)：H1173-1184.

[23]Potente M，Gerhardt H，Carmeliet P.Basic and therapeutic aspects of angiogenesis[J].Cell，2011，146(6)：873-887.

[24]Xu G，Zhao W，Zhou Z，et al.Danshen extracts decrease blood c reactive protein and prevent ischemic stroke recurrence：a controlled pilot study[J].Phytother Res，2009，23(2)：1721-1725.

[25]劉劍剛，張大武，李婕，等.丹參、紅花水溶性組分及配伍對大鼠心肌缺血/再灌注損傷作用的實驗研究[J].中國中藥雜志，2011，36(2)：189-194.

[26]Deng M，Gu Y，Liu Z，et al.Endothelial differentiation of human adipose-derived stem cells on polyglycolic acid/polylactic acid mesh[J].Stem Cells Int，2015，2015：350718.

[27]Ma XJ，Yin SJ，Jin JC，et al.Synergistic protection of danhong injection and ischemic postconditioning on myocardial reperfusion injury in minipigs[J].Chin J Integr Med，2010，16(6)：531-536.

(本文編輯王雅潔)

Danhong Injection Improves Promotes Angiogenesis in Diabetic Mice with Lower Limb Ischemia

Zhang Zhengyan，Wang Peng，Wu Feng，Wu Zonggui

Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

Abstract：Objective To investigate effect and mechanism of Danhong injection (DHI) on angiogenesis in the diabetic hind-limb ischemia mouse model.MethodsThirty diabetic hind-limb ischemic model mice and ten normal mice，established by intraperitoneal (i.p.) injection of streptozotocin (STZ) or PBS and ligation/excision of femoral artery，then，twenty diabetic hind-limb ischemic model mice of all were evenly randomized to saline (control) and DHI i.p.injection (2 μL/g weight for 7days) groups.Limb perfusion recovery and femoral vessel regeneration and lower limb vascular endothelial growth factor (VEGF) expression were evaluated during intervention and after euthanasia，respectively. Results DHI i.p.increased ischemic limb perfusion and promoted collateral circulation generation without decreasing blood glucose level.Increased local VEGF expression contributed to beneficial effects of DH injection.(n=10，P<0.05).Conclusion The activation of local VEGF signal pathway might participate in pro-angiogenesis effects of DHI injection in diabetic hind-limb ischemia model mice，suggesting a potential therapy for diabetic patients with critical limb ischemia.

Key words：Danhong injection；diabetic hind-limb ischemia；angiogenesis；mice；vascular endothelial growth factor

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81130065，81503371)

通訊作者：吳宗貴，E-mail：wu_zonggui@yeah.net

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.007

文章編號：1672-1349(2016)10-1078-05

Corresponding Author:Wu Zonggui

(收稿日期：2016-02-20)

·基礎醫學論著/研究·