調心安神針法對室性心律失常模型兔心肌細胞Cx43磷酸化表達的影響

王　銳，郭　麗 ，李永春 ，崔華峰 ，安　娜

調心安神針法對室性心律失常模型兔心肌細胞Cx43磷酸化表達的影響

王銳1，郭麗1，李永春2，崔華峰1，安娜2

1.山東中醫藥大學附屬醫院(濟南 250011)，E-mail：sdgli1015@sohu.com；2.山東中醫藥大學

摘要：目的觀察調心安神針法對室性心律失常模型兔心肌細胞縫隙連接蛋白43磷酸化(connexin-43 phosphate，p-Cx43)的影響。方法采用兔耳緣靜脈注射氯化鋇的方法制作室性心律失常模型。40只新西蘭兔隨機分為對照組、模型組、針刺組、藥物組，針刺組施以調心安神針刺法(取穴：靈臺、神道、雙側內關、百會)，藥物組給予心律平灌胃。實驗完畢后取兔左心室，Western印跡技術及激光共聚焦顯微鏡對p-Cx43的表達進行分析。結果模型組p-Cx43表達最低，藥物組、針刺組略高于對照組。結論上調p-Cx43的表達可能是該針法治療心律失常的機制之一。

關鍵詞：室性心律失常；調心安神針法；縫隙連接蛋白43磷酸化；兔

心肌細胞縫隙連接蛋白43(connexin-43 phosphate，Cx43)與心律失常的發生有密切的聯系。Cx43的重構，包括Cx43 基因表達、數量及磷酸化水平的改變以及重新分布等，會導致心肌細胞間電活動的同步性、協調性改變，電傳導速度及各向異性的改變等，從而誘發心律失常。筆者基于多年臨床經驗，由靈臺、神道、內關、百會穴組成調心安神方，并施行特定的手法操作，治療早搏取得了滿意的療效[1]。本實驗采用兔耳緣靜脈注射氯化鋇的方法制作室性心律失常模型[2]，觀察調心安神針法對其心肌細胞Cx43磷酸化水平的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑新西蘭兔40只，體重1.5 kg～2.0 kg，雌雄各半，由山東省農科院提供，合格證號：SCXK(魯)20090013。一抗：Beta-actin(博奧森，貨號bs-0061R)，Cx43(博奧森，貨號bs-8987R)，p-Cx43(博奧森，貨號bs-3098R)；二抗：山羊抗兔(Goat anti-rabbit IgG/HRP，博奧森，貨號bs-0295G-HRP)，山羊抗兔488熒光二抗(Invitrogen公司，貨號A11034)。

1.2分組與建模40只新西蘭兔按照隨機數字表法分為對照組、模型組、針刺組、藥物組，每組10只。10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉(心律平組給藥1 h后)，仰位固定于兔固定臺上。將針形電極插入四肢遠端皮下，選擇標準Ⅱ導聯，待心電圖穩定后沿耳緣靜脈注射20%氯化鋇10 mL/kg造成室性心律失常模型。藥物組給予心律平40 mg/kg灌胃，其余各組不予處理。

1.3針刺方法參照中國針灸學會實驗針灸專業委員會制訂的“動物針灸穴位圖譜”，針刺組于造模后即刻給予針刺內關、百會、靈臺、神道。靈臺、神道穴位于背部正中線上，分別為胸椎六、七及五、六棘突間，向上斜刺5 mm，用震顫法快速小幅度行針1 min后起針；百會穴向后平刺5 mm；內關穴位于前臂下1/6折點處內側，橈、尺骨間隙中，雙側內關分別直刺5 mm，行針1 min后接電針治療儀，疏密波，刺激強度以家兔上肢出現輕微顫動為度。各組均觀察體表心電變化，留針至恢復正常心律后停止記錄，拔出針電極，立即處死動物，取左心室。

1.4觀察指標

1.4.1Western blot技術方法檢測Cx43、p-Cx43將樣品加入到PAGE的加樣孔中，80 V電泳30 min左右，待溴酚藍標記的樣品帶進入分離膠后，改至100 V繼續電泳，直至溴酚藍出膠后卸膠。Bio-Rad 濕法轉移系統將蛋白從PAGE膠轉移至PVDF膜，冰水浴中100 V轉移2 h。將膜放置于脫脂牛奶封閉緩沖液中，室溫下置于搖床上孵育1 h。棄去封閉液，按推薦的稀釋比配制針對各蛋白的一抗加到膜上，室溫孵育2 h或4 ℃過夜；用洗滌液洗膜4次，每次10 min。再按推薦比例稀釋HRP偶聯二抗，加入到膜上，室溫孵育45 min；用洗滌液洗膜4次，每次10 min。配制ECL發光試劑，均勻鋪于膜上，反應2 min后吸去，用Fusion FX化學發光成像儀掃描圖像并分析。

1.4.2制備冰凍切片和激光共聚焦顯微鏡觀察p-Cx43分布取左心室心肌組織，組織切片與心肌縱軸平行，制備8 μm厚的冰凍切片，丙酮-20℃固定5 min，以備免疫熒光標記。切片用雙蒸水漂洗3次，每次漂洗2 min，然后用0.25%Triton X-100處理10 min，經PBS漂洗后用10%羊血清白蛋白封閉20 min，用1∶100稀釋的Cx43和p-Cx43多克隆抗體4℃孵育過夜，用PBS漂洗3次，每次漂洗2 min，滴加1∶400稀釋的IgG-FITC二抗，室溫閉光孵育2 h，用PBS漂洗3次，每次5 min，甘油封片。當天用激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss，LSM780)觀察，用488 nm波長激發FITC，發生光為519 nm綠光。每張切片取(4～6)個視野，選擇細胞縱行走向區域進行觀察并拍照。

2結果

2.1Western blot檢測結果對照組Cx43蛋白表達最高，模型組最低，藥物組略高于針刺組；模型組p-Cx43表達最低，針刺組、藥物組略高于對照組。詳見圖1。

圖1Vesternblot檢測結果

2.2免疫熒光染色綠色熒光斑標記p-Cx43，藍色標記細胞核。結果顯示，對照組熒光斑形態清晰，分布均勻，在細胞端端連接處為主；模型組熒光斑明顯數量減少，形態相對粗亂，端端分布減少，呈不均一分布；針刺組及藥物組熒光斑數量增多，改變較少。詳見圖2～圖5。

圖2對照組免疫熒光染色圖3模型組免疫熒光染色圖4針刺組免疫熒光染色圖5藥物組免疫熒光染色

3討論

正常情況下的心肌細胞間存在著磷酸化和去磷酸化兩種狀態的Cx43，但僅磷酸化的Cx43 構成有功能的縫隙連接通道[3]。持續缺血能夠導致磷酸化Cx43水平下降而去磷酸化的Cx43水平升高，同時各種心律失常的發生率( 如室性期前收縮、室性心動過速和心室顫動等) 明顯增加，表明缺血心肌中Cx43 的去磷酸化與心律失常的發生有關[4-5]；近年合成的抗心律失常多肽即通過上調Cx43的磷酸化水平而發揮抗心律失常作用[6]。本研究表明，耳緣靜脈注射氯化鋇造成兔室性心律失常模型，其左心室心肌細胞Cx43及p-Cx43表達均下降，調心安神針法及心律平皆能上調二者的表達，且對于p-Cx43的上調作用尤為明顯。

心律平作為臨床上最常用的抗心律失常藥物，有輕度β-受體阻斷作用和輕微的鈣通道阻滯作用[7]。這可能是心律平通過降低細胞內Ca2+的濃度， Ca2+依賴性蛋白酶如蛋白激酶A、C、G(PKA、PKC、PKG)等都會受到抑制，由于這些蛋白激酶都參與連接蛋白的磷酸化過程[8]，從而增加了Cx43及p-Cx43的表達。

Cx43可能是構成穴位的主要物質基礎之一，針刺后穴位處Cx43表達增加，激活了間隙連接通道，促進了Ca2+、環磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)或其他小分子物質快速傳遞至相應臟器，形成了“氣至病所”的物質基礎[9]，進而調節臟器功能。調心安神針法治療室性心律失常取得較好的臨床療效，對于Cx43的調節，包括增加Cx43的表達及促進Cx43磷酸化，可能即是其作用機制之一。

參考文獻：

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(本文編輯王雅潔)

Effect of Tiaoxin Anshen Acupuncture on the Expression of Myocardial Connexin-43 Phosphate in Rabits with Ventricular Arrhythmia

Wang Rui，Guo Li，Li Yongchun，Cui Huafeng，An Na

The Affiliated Hospital，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，Shandong，China

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Tiaoxin Anshen acupuncture on the expression of myocardial connexin-43 phosphate(p-Cx43) in rabits with ventricular arrhythmia.MethodsForty rabits were randomly divided into four groups： the control group， the model group， the acupuncture group treated with Tiaoxin Anshen acupuncture(points selected Lingtai points， Shendao points， Neiguan points on both sides and Baihui points)，and the propafenone group treated with propafenone by intragastric.Rabits of the acupuncture group received treatment of.Left ventricle of all the rabbits were taken out to test p-Cx43 protein expression by western bolt and laser scanning confocal microscope.ResultsThe expression of p-Cx43 was lowest in the model group.The expressions of p-Cx43 in the acupuncture group and the propafenone group were slightly higher than that in the control group.ConclusionThe up-regulating the expression of p-Cx43 might be one of the therapeutic target spots of Tiaoxin Anshen acupuncture for ventricular arrhythmia.

Key words：Tiaoxin Anshen acupuncture；ventricular arrhythmia；connexin-43 phosphate；rabits

中圖分類號：R541R245

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.009

文章編號：1672-1349(2016)10-1085-03

(收稿日期：2015-07-01)