凝血酶原基因rs5896位點C＞T多態性與腎結石的相關性

季慧娟，陳陶，江明華，王大文，王怡君，胡云良

（溫州醫科大學附屬第二醫院，浙江　溫州　325027，1.檢驗科；2.泌尿外科）

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凝血酶原基因rs5896位點C＞T多態性與腎結石的相關性

季慧娟1，陳陶1，江明華1，王大文2，王怡君2，胡云良1

（溫州醫科大學附屬第二醫院，浙江溫州325027，1.檢驗科；2.泌尿外科）

［摘 要］目的：探討凝血酶原基因rs5896位點C＞T多態性與浙南地區人群腎結石的相關性。方法：采用PCR-RFLP和測序技術分析102例腎結石患者（病例組）和年齡相匹配的95例健康人群（對照組）凝血酶原基因rs5896位點，比較此位點2組間基因型頻率和等位基因頻率差異。結果：凝血酶原基因rs5896位點CC、CT和TT基因型頻率在病例組為13.7%、50.9%和35.4%，對照組為24.2%、51.6%和24.2%，2組比較差異有統計學意義（P=0.028）；等位基因C、T頻率在病例組和對照組分別為39.2%、60.8%和50.0%、50.0%，差異有統計學意義（P=0.031）。結論：凝血酶原基因rs5896位點多態性與浙南地區人群患腎結石具有關聯性，rs5896位點C＞T變異可能是腎結石的易感因素。

［關鍵詞］多態性；凝血酶原基因；腎結石

我國泌尿系結石發病率為1%～5%，復發率高達50%左右，發病率存在地區差異［1］。腎結石成因復雜，往往包含多種致病因素，主要由感染性因素、代謝性因素、遺傳性因素等造成。本研究通過分析浙南地區人群凝血酶原基因rs5896位點多態性與腎結石的相關性，來了解凝血酶原基因rs5896位點多態性是否對浙南地區人群腎結石的發病率有影響。

1　材料和方法

1.1一般資料 依據《歐洲泌尿外科學會2006年泌尿系結石診治指南》，收集2014年9月至2015年8月在溫州醫科大學附屬第二醫院入院的腎結石病例102例。其中男55例，女47例，年齡18～80歲，平均（53.50±13.73）歲。選擇年齡、性別相匹配的健康體檢者95例作為對照組，其中男51例，女44例，年齡18～86歲，平均（59.19±17.41）歲。

1.2基因組DNA提取 收集以乙二胺四乙酸鉀（EDTA-K2）抗凝的血液2 mL，-20 ℃保存。采用人類基因組DNA提取試劑盒（RelaxGene Blood DNA System，TIANGEN）提取全血基因組DNA（嚴格按說明書操作），-20 ℃留存。

1.3引物設計與合成 根據GeneBank NG_008953序列，采用Primer Premier 5.0分析軟件設計rs5896位點引物，上游引物（5’-3’）：CTCAGGGCCTTGGCCTG TGCGC，下游引物（5’-3’）：CTTGTGAGACAGCGAGGACG CC，由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.4聚合酶鏈反應（PCR）擴增及基因型檢測 體系總體積為30 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，10×loading buffer 3 μL，dNTP 2 μL，taq 酶0.2 μL（購自Takara公司），ddH2O 21.8 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；30個循環后72 ℃延伸10 min。擴增出大小為550 bp的DNA目的片段。然后采用特異性限制性內切酶Ncol（Fermentas，ER0571）依據說明書反應條件進行酶切：ddH2O 7 μL，10×buffer tango 2 μL，DNA（0.5～1 μg）10 μL，Ncol 0.5 μL，取酶切后產物6 μL經5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將PCR產物送上海桑尼生物科技有限公司測序，所用測序儀器為ABIPRISM3720。

1.5氨基酸序列同源分析 使用ClustalW軟件（http︰//www.ebi.ac.uk/clustalw/）對來源于NCBI數據庫的蛋白序列進行同源比對。

1.6統計學處理方法 各基因型、基因頻率在病例組和對照組人群分布差異采用chi-square檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1電泳圖 含凝血酶原基因rs5896位點經上述引物擴增的目的片段為550 bp，利用Ncol酶對該片段的限制性酶切位點的識別不同，550 bp大小的目的片段可被切割成不同的小片段（見圖1）。

2.2測序圖譜 凝血酶原rs5896位點的多態性可表示為CC、CT和TT基因型（見圖2）。

2.3Hardy-Weinberg遺傳平衡分析 凝血酶原基因rs5896位點各基因型（CC、CT和TT）分布符合Hardy-Weinberg定律（P＞0.05）（見表1），標本具有群體代表性。

2.4基因型和等位基因頻率比較 凝血酶原基因rs5896位點CC、CT、TT基因型頻率在病例組和對照組分別為13.7%、50.9%、35.4%和24.2%、51.6%、 24.2%，差異有統計學意義（P=0.028）（見表2）；等位基因C頻率在病例組為39.2%，等位基因T在病例組分布頻率為60.8%，與對照組比差異有統計學意義（P=0.031）（見表3）。病例組TT基因型易感性OR值是對照組CC基因型的2.57倍（P=0.027，95%CI：1.104～5.990）。

圖1　凝血酶原基因rs5896位點的PCR-RFLP電泳分析結果

圖2　凝血酶原基因rs5896位點測序結果

表1　凝血酶原基因rs5896位點基因型遺傳平衡性檢驗

表2　不同組別間rs5896位點多態性基因型的比較　［n（%）］

表3　不同組別rs5896位點的C、T等位基因頻率的比較（%）

圖3　凝血酶原165位氨基酸序列的保守性分析

2.5保守性分析結果 蛋白序列同源比對發現，凝血酶原基因rs5896位點所編碼的氨基酸，在其他幾種維生素K依賴的凝血因子蛋白中高度保守；同時在不同物種間凝血酶原也具備高度的保守性（見圖3）。

3　討論

腎結石具有區域流行性的特征，是南方人群中常見的疾病，不僅給患者帶來痛苦，也給社會醫療增加了巨大的經濟負擔。腎結石是由遺傳易感性和環境因素共同作用的疾病。有文獻報道，骨橋素蛋白、維生素D受體、鈣敏感受體等基因異常都與結石具有一定關聯性。雖然臨床利用B超引導方式治療腎結石方法較為成熟［2］，但能盡早預防腎結石的發生發展和腎結石的再次復發更有利于減輕患者的痛苦。目前腎結石發病機制仍未明，而具體的致病機制有待于進一步研究［3］。大多數泌尿系結石與鈣鹽代謝相關［4］，據報道凝血酶原結構異常與含鈣結石具有一定的相關性［5］，影響腎結石的成核、聚集和結晶的形成。凝血酶原主要由肝臟細胞合成和分泌，近年來在腎臟中也有表達。凝血酶原相對分子質量（MW）為71 600，糖含量為8.2%，是由579個氨基酸殘基組成的單鏈糖蛋白，分4個功能域區：1個γ羧基谷氨酸區（Gla）、2個環狀區（K1、K2）和1個催化區，其編碼基因定位于11p11-q12，由14個外顯子與13個內含子組成，長約21 kb，其mRNA總長度約為2.1 kb。2個環狀功能區域由外顯子4～7編碼，K1、K2各含有約80個氨基酸，兩者均借助于二硫鍵分別形成三環狀結構。凝血酶原經過內或外源凝血途徑激活，釋放出凝血酶原分子氨基末端的片段1+2（含分子的Gla區和2個K區）。尿凝血酶原片段1（urinary prothrombin fragment 1，UPTF1）是人類凝血酶原激活后的裂解片段，分子量31 kD，屬糖蛋白，可作為草酸鈣結石的抑制蛋白［6］；氨基酸序列分析發現在該蛋白近N-終末端含Gla殘基，是該蛋白的鈣離子結合部位，在人體未稀釋的尿液中或無機環境下，它是含鈣結石晶體發生發展的抑制蛋白［7］。

凝血酶原基因rs5896位點位于編碼區的第6外顯子，相應編碼的氨基酸在凝血酶原K1區內，而K1區被認為在機體凝血過程中參與凝血酶（原）與其底物及輔因子的相互作用中扮演重要的角色［8-9］。通過蛋白序列進行同源比對，發現凝血酶原基因rs5896位點編碼的165位氨基酸在其他幾種維生素K依賴的凝血酶原中高度保守；同時在不同物種間凝血酶原該位點同樣具備高度的保守性，推測該165位的氨基酸殘基與凝血酶原功能的特異性密切相關（見圖3）。凝血酶原基因rs5896位點上C＞T的基因突變可導致UPTF1片段165位氨基酸由極性不帶電荷的蘇氨酸被非極性的甲硫氨酸替代，由于165位的甲硫氨酸不能與180位的谷氨酸形成正常情況下的氫鍵，可引起蛋白質的空間構象改變［10］。進而也影響著UPTF1片段的糖基化及唾液酸化，UPTF1的糖基化可控制草酸鈣晶體的成核和聚集而唾液酸化在抑制草酸鈣結石晶體的形成過程中起關鍵作用［11-12］。

我們通過對浙南地區102例腎結石患者和95例健康人群凝血酶原基因rs5896位點的多態性研究發現，病例組TT基因型易感性是對照組CC基因型的2.57倍（P=0.027，95%CI：1.104～5.990），差異有統計學意義。等位基因C頻率在病例組低于對照組，差異有統計學意義。本研究結果提示，凝血酶原基因rs5896位點的C等位基因編碼的蘇氨酸可能是腎結石的保護基因，該位點的C＞T變異導致的165位的蘇氨酸被甲硫氨基酸替代，可減少UPTF1的糖基化和唾液酸化，從而影響UPTF1對草酸鈣晶體形成的抑制活性。然而關于UPTF1致使腎結石形成的確切機制有待于進一步闡明。由于本研究樣本量較少可能會帶來誤差，需要今后進一步擴大樣本量來研究驗證。

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（本文編輯：吳昔昔）

Correlation between prothrombin gene polymorphism of rs5896 C＞T and kidney stone

JI Huijuan1，CHEN Tao1， JIANG Minghua1， WANG Dawen2， WANG Yijun2， HU Yunliang1. 1.Department of Clinical Laboratory， the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.Department of Urinary Surgery， the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Abstract：Objective： To investigate the correlation between prothrombin rs5896 C＞T genetic polymorphism and kidney stone in the southern population of Zhejiang. Methods： Prothrombin gene polymorphism rs5896 was investigated in 102 patients with renal stone formation and 95 age-matched healthy volunteers without history of renal stone formation， using polymerase chain reaction-restriction fragment polymorphism （PCR-RFLP） and sequencing. The frequences of genetype and allele gene in the case and control were analyzed. Results： The frequencies of CC， CT， TT were 13.7%， 50.9%， 35.4% and 24.2%， 51.6%， 24.2% in kidney stone patients and healthy controls respectively. The difference between case and control was slight signifi cance （P=0.028）. The frequencies of C and T were 39.2%， 60.8% and 50.0%， 50.0% in kidney stone patients and heathy control. There was a different signifi cance （P=0.031）. Conclusion： It suggests that the rs5896 polymorphism of prothrombin gene is associated with the kidney stone in the southern population of Zhejiang， and it is possible that rs5896 C＞T acts as a risk factor for the development of renal stone disease.

Key words：polymorphism； prothrombin gene； kidney stone

［中圖分類號］R394.3

［文獻標志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.002

收稿日期：2015-10-26

基金項目：高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（2012 3321120002）；浙江省教育廳科研基金資助項目（Y201223619）。

作者簡介：季慧娟（1989-），女，江西撫州人，碩士生。

通信作者：胡云良，教授，Email：hyl@wmu.edu.cn。