高效液相色譜法同時測定遍山紅中8種化學成分含量

潘立衛 羅澤萍 蘇逢晶 賴紅芳

摘要：【目的】建立高效液相色譜法（HPLC）測定遍山紅中沒食子酸、二氫楊梅素、原兒茶酸、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚化學成分含量的方法，以期更好地控制遍山紅的藥材質量，為其藥用開發提供科學依據。【方法】采用ZORBAX SB-C18色譜柱、乙腈-0.2%磷酸為流動相、流速0.6 mL/min、柱溫28 ℃的HPLC測定廣西都安縣4個采集點（弄蒼隊、卜凡隊、弄外隊、百外隊）遍山紅中8種化學成分的含量。【結果】260 nm是測定混合對照品溶液和遍山紅供試液中8種化學成分的最大波長。4個采集點遍山紅中8種化學成分的含量范圍：沒食子酸1.53～1.75 mg/g、原兒茶酸1.11～1.28 mg/g、二氫楊梅素0.99～1.44 mg/g、蘆丁0.34～0.42 mg/g、楊梅苷1.58～1.83 mg/g、齊墩果酸0.63～0.77 mg/g、槲皮素1.03～1.11 mg/g、山柰酚0.65～0.69 mg/g。8種化學成分質量濃度與峰面積線性關系及色譜峰分離效果均良好（r >0.9990）；沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素和山柰酚的進樣量范圍分別為7.20～43.20、3.36～20.16、5.92～35.52、1.60～9.60、6.40～38.40、3.68～22.08、3.20～19.20和3.52～21.12 μg/mL，對應的平均加樣回收率為101.72%、96.49%、97.04%、99.79%、99.80%、99.44%、101.52%和96.63%。【結論】建立的HPLC具有操作簡便、準確可靠、靈敏度高、重現性好等優點，可用于遍山紅的質量控制。

關鍵詞： 遍山紅；化學成分；高效液相色譜法；含量測定

中圖分類號： R284.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1939-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to establish high performance liquid chromatography（HPLC） method for determination of gallic acid， dihydromyricetin， protocatechuic acid， rutin， myricetrin， oleanic acid， quercetin and kaempferol in Oxyspora paniculata（Don） DC. in order to better control the quality and provide scientific basis for its medicinal development. 【Method】The eight kinds of chemical components in O. paniculata from four collection sites in Duan county， Guangxi（Nongcang hamlet，Bofan hamlet，Nongwai hamlet，Baiwai hamlet） were measured by HPLC method with ZORBAX SB-C18 column， acetonitrile-0.2% H3PO4 mobile phase， 0.6 mL/min flow rate and 28 ℃ column temperature. 【Result】260 nm was the maximum wave lengths for determined of mixed reference substances solution and eight chemical components in O. paniculata tested solution. Contents of the eight chemical components in O. paniculata collected from the four collection sites were as follows： gallic acid 1.53-1.75 mg/g， protocatechuic acid 1.11-1.28 mg/g， dihydromyricetin 0.99-1.44 mg/g， rutin 0.34-0.42 mg/g， myricetrin 1.58-1.83 mg/g， oleanic acid 0.63-0.77 mg/g， quercetin 1.03-1.11 mg/g and kaempferol 0.65-0.69 mg/g. Linear relations between mass concentration and peak area and chromatographic peak separation effects of the eight chemical components were sound（r>0.9990）. Sample sizes of the eight chemical components were as follows： gallic acid 7.20-43.20 μg/mL， protocatechuic acid 3.36-20.16 μg/mL， dihydromyricetin 5.92-35.52 μg/mL， rutin 1.60-9.60 μg/mL， myricetrin 6.40-38.40 μg/mL， oleanic acid 3.68-22.08 μg/mL， quercetin 3.20-19.20 μg/mL and kaempferol 3.52-21.12 μg/mL. Sample recovery rates of the eight chemical components were as follows： gallic acid 101.72%， protocatechuic acid 96.49%， dihydromyricetin 97.04%， rutin 99.79%， myricetrin 99.80%， oleanic acid 99.44%， quercetin 101.52% and kaempferol 96.63%. 【Conclusion】The HPLC method for O. paniculata is simple， feasible， accurate， reliable， highly sensitive and reproducible， which can be used in quality control of. O. paniculata.

Key words： Oxyspora paniculata（Don） DC.； chemical component； high performance liquid chromatography（HPLC）； content determination

0 引言

【研究意義】遍山紅又名大葉朝天罐、酒瓶果、硯山紅，為野牡丹科植物尖子木[Oxyspora paniculata （Don） DC.]的根或全株，主要分布于我國廣西、貴州、云南、西藏等地（中國科學院中國植物志編輯委員會，1984；國家中醫藥管理局《中華本草》編委會，1999）。民間常用其治療濕熱瀉痢、風濕痛、尿血、月經過多、產后血崩、瘡腫、跌打腫痛等癥（四川省中草研究所，1971）。已有研究從遍山紅中分離純化出β-谷甾醇、胡蘿卜苷、熊果酸、沒食子酸、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚等多個單體化合物（王皓等，2003）。本課題組的前期化學成分研究也發現不同產地的遍山紅藥材中均含有沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚等化學成分，大致以黃酮和酚酸兩大類成分為主，但至今尚未發現遍山紅化學成分含量測定方法的相關報道，難以全面控制其質量。因此，建立同時測定遍山紅中化學成分含量的方法，對合理開發利用廣西遍山紅藥材資源具有重要意義。【前人研究進展】目前，國內對遍山紅的研究主要集中在植物分類學、資源學等領域（Liao et al.，2006；趙健等，2008），對其化學成分和藥理作用的研究甚少。而關于野牡丹科植物化學成分含量測定的研究報道較多，且多采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定。翟小玲（2007）采用HPLC[甲醇-0.1%磷酸（10∶90）為流動相，Hypersil ODS2為色譜柱，流速0.5 mL/min，檢測波長273 nm]測定地菍胃內漂浮片中的沒食子酸和槲皮素含量，結果表明，在色譜條件下樣品中沒食子酸和槲皮素分離良好，含量分別為4.86%和0.0312%。劉燕和唐鐵鑫（2011）采用HPLC[流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50），色譜柱Shimpack VP-ODS C18，流速1.0 mL/min，檢測波長360 nm]測定野牡丹中槲皮素含量，結果表明該方法結果可靠、準確性高、實用性強，3個產地的野牡丹樣品槲皮素含量分別為0.3815%、0.3542%和0.4378%。鄒準等（2012）采用HPLC測定了10個批次羊開口中沒食子酸和鞣花酸含量，得到沒食子酸和鞣花酸平均加樣回收率分別為100.15%和97.20%，含量范圍分別為0.076～0.332和0.022～0.646 mg/g。范蕾等（2013）采用HPLC測定6個產地畬藥地稔中沒食子酸和槲皮素含量，結果顯示該方法簡便快速、誤差小、結果可靠，沒食子酸和槲皮素平均加樣回收率分別為97.72%和99.75%，含量范圍分別為0.85～1.92和0.24～0.33 mg/g。曹丹等（2015）采用SunFireTM C18色譜柱、檢測波長365 nm、流動相為甲醇-0.2%甲酸水溶液、流速1.0 mL/min、柱溫40 ℃的HPLC測得地菍中牡荊素和異牡荊素含量分別為1.25和1.86 mg/g。【本研究切入點】目前尚無關于遍山紅化學成分含量測定及質量標準控制方面的研究報道。【擬解決的關鍵問題】在前期化學成分研究的基礎上，采用HPLC同時測定遍山紅中沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚8種化學成分含量，建立遍山紅藥材的質量控制方法，為其藥用開發提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

遍山紅藥材分別采自廣西都安縣保安鄉保安村的弄蒼隊、卜凡隊、弄外隊和百外隊，經河池學院化學與生物工程學院鄧晰朝副教授鑒定為野牡丹科遍山紅的全株。對照品：槲皮素（批號2015080）和蘆丁（批號20150702）購自上海金穗生物科技有限公司；山柰酚（批號20150410）和楊梅苷（批號20150302）購自西安瑞迪生物科技有限公司；二氫楊梅素（批號27200120）購自西安玉泉生物科技有限公司；齊墩果酸（批號110709200304）和原兒茶酸（批號110809200503）購自中國藥品生物制品檢定所；沒食子酸為自制，純度98.4%。其他試劑均為國產分析純；試驗用水為純凈水。主要儀器設備：Agilent 1260型高效液相色譜儀、Agilent 1260 series色譜工作站、Agilent 8453型紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；KQ250DE超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；98-1-B電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；AUW220D型十萬分之一天平（日本島津公司）；MilliporeD-Q3超純水機（美國密理博公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 混合對照品溶液制備 稱取適量沒食子酸、原兒茶酸等8種對照品，加入70%乙醇溶解，并定容至10 mL，配制成每1 mL含沒食子酸0.45 mg、原兒茶酸0.21 mg、二氫楊梅素0.37 mg、蘆丁0.10 mg、楊梅苷0.40 mg、槲皮素0.20 mg、山柰酚0.22 mg、齊墩果酸0.23 mg的混合對照品溶液。

1. 2. 2 供試品溶液制備 遍山紅藥材全株用鍘刀切段，自然干燥后打碎成粗粉，過40目篩，備用。精密稱取藥材粉末2 g置于具塞錐形瓶，加入75 mL 70%乙醇，密塞、稱重，設定溫度80 ℃，電熱套回流提取60 min，放冷稱重，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻、過濾，取續濾液10 mL，定容至50 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾即得。穩定性、重復性、加樣回收率和樣品含量測定試驗的供試品制備方法均同上。

1. 2. 3 最大吸收波長確定 取混合對照品溶液，用70%乙醇稀釋100倍后，利用紫外二極管陣列分光光度計進行全波長掃描，確定最大吸收波長。

1. 2. 4 色譜條件 ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.2%磷酸（B）為流動相進行梯度洗脫（表1），設定流速0.6 mL/min、檢測波長260 nm、柱溫28 ℃、進樣量5 μL。

1. 2. 5 標準曲線線性確定 精確移取混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 mL分別置于25 mL容量瓶中，依次稀釋定容，取上述各溶液按1.2.4分別進樣5 μL。以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，求出線性回歸方程及相關系數。

1. 2. 6 精密度試驗 取同一混合對照品溶液重復進樣6次，每次5 μL，測定峰面積，計算精密度。

1. 2. 7 穩定性試驗 遍山紅藥材供試液于室溫分別放置2、4、6、8、12、24 h后，按1.2.4測定峰面積。

1. 2. 8 重復性試驗 精確稱取6份同一采集點遍山紅藥材粉末2 g，按1.2.2制備供試液，按1.2.4測定峰面積。

1. 2. 9 加樣回收率試驗 精確稱取6份已知含量的遍山紅粉末1 g，分別加入25 mL混合對照品稀釋溶液（含沒食子酸0.060 mg/mL、原兒茶酸0.044 mg/mL、二氫楊梅素0.036 mg/mL、蘆丁0.012 mg/mL、楊梅苷0.072 mg/mL、齊墩果酸0.028 mg/mL、槲皮素0.044 mg/mL、山柰酚0.028 mg/mL），按1.2.4測定供試溶液，計算供試樣液含量和回收率，考察方法的準確性和可靠性。

回收率（%）=（測得量-已知量）/加入量×100

1. 2. 10 樣品含量測定 按1.2.4測定4個采集點遍山紅中沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚8種化學成分的含量，5次重復，記錄對照品、樣品色譜圖及峰面積，并用外標法計算各采集點遍山紅中8種成分含量的平均值。

M=C×V×n/m

式中，M為遍山紅藥材粉末含量（mg/g），C為供試液質量濃度（mg/mL），V為供試液體積（75 mL），n為稀釋因子，m為遍山紅樣品質量（g）。

2 結果與分析

2. 1 最大吸收波長的確定

利用紫外二極管陣列分光光度計，在190～800 nm范圍內對混合對照品溶液中沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚進行全波長掃描，結果見圖1。由圖1可知，混合對照品溶液最大紫外吸收峰分別為210、260和289 nm；為確保各成分均在其最大吸收波長下進行測定，提高分析方法的靈敏度，本研究選擇260 nm作為測定遍山紅中8種化學成分的最大吸收波長。

2. 2 標準曲線的線性考察結果

由表2可知，遍山紅中沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚8種化學成分進樣量范圍分別為7.20～43.20、3.36～20.16、5.92～35.52、1.60～9.60、6.40～38.40、3.68～22.08、3.20～19.20和3.52～21.12 μg/mL；進樣線性范圍內相關系數r均大于0.9990，表明各成分在相應進樣量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2. 3 精密度試驗結果

由表3可知，沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素和山柰酚的相對標準偏差（RSD）分別為0.34%、0.48%、0.36%、0.35%、0.05%、0.79%、0.06%和0.19%，均小于2.00%，表明儀器精密度良好。

2. 4 穩定性試驗結果

由表4的峰面積可計算得到沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素和山柰酚的RSD分別為0.16%、0.30%、1.26%、0.58%、0.15%、1.24%、0.33%和0.30%，均小于2.00%，說明被測供試品溶液在24 h內表現出良好的穩定性。

2. 5 重復性試驗結果

由表5可知，以HPLC測定遍山紅中沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素和山柰酚，其RSD分別為0.21%、0.83%、1.98%、0.32%、0.43%、1.14%、0.43%和0.45%，均小于2.00%，表明該方法重復性良好。

2. 6 加樣回收率試驗結果

由表6可知，沒食子酸、原兒茶酸、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素和山柰酚的平均回收率分別為101.72%、96.49%、97.04%、99.79%、99.80%、99.44%、101.52%和96.63%，對應的RSD為1.89%、1.10%、1.68%、1.72%、2.06%、1.98%、1.04%和1.52%。說明采用HPLC法測定遍山紅中8種化學成分含量具有較好的準確性和可靠性。

2. 7 不同采集點遍山紅中8種化學成分含量的測定結果

由圖2可知，8種化學成分組間分離度均大于1.50，理論塔板數按各成分計算不少于3000，基本能將待測成分完全分離，達到色譜分離要求，柱效良好。其中成分4和成分5靠得較近，通過色譜工作站數據分析，分離度達1.73，理論塔板數大于10000，滿足測試條件。

由表7可知，4個采集點遍山紅的8種化學成分含量范圍：沒食子酸1.53～1.75 mg/g、原兒茶酸1.11～1.28 mg/g、二氫楊梅素0.99～1.44 mg/g、蘆丁0.34～0.42 mg/g、楊梅苷1.58～1.83 mg/g、齊墩果酸0.63～0.77 mg/g、槲皮素1.03～1.11 mg/g、山柰酚0.65～0.69 mg/g；其中百外隊遍山紅的沒食子酸、二氫楊梅素、蘆丁和槲皮素含量最高，卜凡隊遍山紅的原兒茶酸和齊墩果酸含量最高，弄蒼隊遍山紅的楊梅苷含量最高，而4個采集點的山柰酚含量無明顯差別。總體上來看，4個采集點遍山紅的8種化學成分含量均無顯著差異（P>0.05），表明所采集的藥材在該地區無地域性差異。

3 討論

目前，中藥材的化學成分含量測定方法主要有高效毛細管電泳法、氣相色譜法、HPLC、超臨界流體色譜法、離子交換色譜法等，其中HPLC具有分離效果好、選擇性和檢測靈敏度高，分析速度快等優點，應用最廣泛（王新軍等，2014；趙茜和鄒素蘭，2014；祝洪艷等，2015）。本研究采用HPLC測定遍山紅中8種化學成分含量，在前期進行流動相和色譜柱的選擇試驗中，發現以乙腈-0.2%磷酸為流動相進行梯度洗脫時，8種化學成分色譜峰峰形及分離效果較好；ZORBAX SB-C18色譜柱分析效果較好，且所耗溶劑較少、分析時間較短，故以乙腈-0.2%磷酸為流動相，采用窄徑柱ZORBAX SB-C18柱在最佳流速0.6 mL/min下進行試驗，在此條件下基線平穩，分離度大于1.50，柱效高，能滿足含量測定的要求。HPLC測得遍山紅中8種化學成分的平均含量分別為：沒食子酸1.66 mg/g、原兒茶酸1.20 mg/g、二氫楊梅素1.16 mg/g、蘆丁0.37 mg/g、楊梅苷1.74 mg/g、齊墩果酸0.71 mg/g、槲皮素1.07 mg/g、山柰酚0.68 mg/g。與野牡丹科其他植物相比，遍山紅中沒食子酸含量比羊開口沒食子酸含量（0.076～0.332 mg/g）（鄒準等，2012）高，與地稔中沒食子酸含量（0.85～1.92 mg/g）（劉敏等，2012）相近；遍山紅中槲皮素含量高于地稔中槲皮素含量（0.24～0.33 mg/g）（劉敏等，2012），但低于野牡丹中槲皮素含量（3.542～ 4.378 mg/g）（劉燕和唐鐵鑫，2011）。表明野牡丹科中含有一些共有成分，其含量存在不同程度的差異，通常會影響藥材的品質。中藥材所含化學成分相當豐富，目前2015版《中國藥典》所規定的采用1種或2種成分含量測定方法已不能有效地控制其質量，而多種指標成分同時測定是今后控制藥材質量的一種趨勢。本研究采用HPLC同時測定遍山紅中8種化學成分含量，能更全面有效控制遍山紅的質量；且本研究發現上述化學成分在同一色譜條件下均能同時分離測定，該方法簡單快速，重復性好，基本達到由多種有效指標成分定量測定來控制遍山紅藥材內在質量的目的，可用于遍山紅的質量控制。

本研究僅用有限的對照品初步建立遍山紅中8種化學成分的HPLC測定方法，為更好地控制遍地紅的藥材質量，今后可結合LC-MS-MS技術測定盡可能多的指標成分，并考察遍山紅藥材全年不同采集時間、不同藥用部位及不同炮制品的有效成分含量。

4 結論

建立的HPLC可同時測定遍山紅中沒食子酸、二氫楊梅素、原兒茶酸、蘆丁、楊梅苷、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚的含量，具有操作簡便、準確可靠、靈敏度高、重現性好等優點，可用于遍山紅的質量控制。

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（責任編輯 羅 麗）