黃喉擬水龜白眼病病原菌分離鑒定及藥敏試驗

陸專靈 鐘一治 趙忠添 雷燕 韋友傳 張益峰

摘要：【目的】明確黃喉擬水龜白眼病的病原菌及其藥敏特性，為該病的防控提供參考依據。【方法】對患白眼病的黃喉擬水龜進行無菌解剖、劃線培養、分離篩選，對分離獲得的菌株進行培養特征、生理生化特性鑒定、16S rDNA序列分析及同源性比對分析，通過動物致病性試驗鑒定致病性，并采用藥敏試驗檢驗其耐藥性。【結果】從患白眼病黃喉擬水龜稚龜肝臟、肺臟及脾臟中分離獲得的優勢菌株對小白鼠和黃喉擬水龜均有強的致病性，為兼性厭氧、產酸、產氣、發酵型、無運動能力的革蘭氏陰性桿菌，其16S rDNA序列（GenBank登錄號KU855372）與肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的同源性達99.1%。分離菌株對恩諾沙星、頭孢噻吩、頭孢噻肟、氧氟沙星等高度敏感，但對鏈霉素、新霉素、青霉素、卡那霉素、四環素、克林霉素、強力霉素、阿莫西林、復方新諾明等已產生耐藥性。【結論】肺炎克雷伯菌是引起黃喉擬水龜白眼病的主要病原菌，生產中可選用恩諾沙星、氧氟沙星等沙星類或頭孢噻吩、頭孢噻肟等頭孢類藥物進行防治。

關鍵詞： 黃喉擬水龜；白眼病；分離；鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S947.12 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1974-05

Abstract：【Objective】Pathogen of withe eye disease in Mauremys mutica and its drug sensitivity characteristics were confirmed in order to provide reference for prevention and control of the disease. 【Method】Sterile anatomy， streak culture， isolation and selection were applied on M. muticas with withe eye disease. Cultural characteristics and physiological and biochemical characteristics of the isolated strains were identified， 16S rDNA sequence analysis and homology comparison were conducted. Pathogenicity was identified through animal pathogenic experiment and drug resistance was identified through drug sensitivity test. 【Result】A dominant strain was isolated from liver， lung and spleen of M. mutica with withe eye disease， which was strongly pathogenic to mice and M. mutica. The isolated strain was identified to be a gram-negative bacillus with facultative anaerobic， acidogenicity， aerogenesis， fermentation and no exercise ability. The 16S rDNA sequences of the isolated strain（GenBank accession number： KU855372） and that of Klebsiella pneumoniae had 99.1% homology. The isolated strain was hypersensitive to enrofloxacin， cephalothin， cefotaxime and ofloxacin， but showed drug resistance to streptomycin， neomycin， penicillin， kanamycin， tetracycline， clindamycin， doxycycline， amoxicillin and compound sulfamethoxazole. 【Conclusion】K. pneumoniae is one of the main pathogenic bacteria causing withe eye disease of M. mutica. Quinolone and cephalosporin analogues such as enrofloxacin， ofloxacin cephalothin and cefotaxime can be used to prevent and control the disease.

Key words： Mauremys mutica； withe eye disease； isolation； identification； drug sensitivity test

0 引言

【研究意義】黃喉擬水龜（Mauremys mutica）隸屬于龜鱉目淡水龜科，自然分布于越南、日本及我國的東部和南部等地，是具有較高經濟價值的擬水龜品種之一（趙忠添等，2007）。黃喉擬水龜在稚龜階段極易發生白眼病，其臨床癥狀主要表現為眼部發炎充血、眼睛腫大、眼睛外表有黃白色分泌物，病龜精神不振、反應遲頓，不時用前肢抓撓眼部，常浮在水面、張口呼吸，嘴角流出黏液等。由于病龜長期不攝食，加上體內器官受病菌感染，最終衰竭死亡（趙忠添，2006），給黃喉擬水龜養殖業帶來極大的經濟損失。【前人研究進展】目前，有關龜鱉類白眼病的研究報道較少，對其病原菌的鑒定結果也各不相同。伍惠生（2001）推測烏龜眼部受細菌感染可導致白眼病，使用呋喃類、紅霉素等藥物進行防治有一定效果；章劍（2001）初步鑒定鱷龜白眼病的病原為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）；于清泉（2003）研究發現，在龜白眼病初期可選用利福平眼藥水滴眼、麥迪霉素片拌料或鏈霉素腹腔注射，均可獲得良好的防效；趙忠添（2006）對黃喉擬水龜白眼病進行防治初探，發現鏈霉素、羅紅霉素等抗菌素對黃喉擬水龜白眼病治療有一定作用；萬輯（2007）研究表明，七彩龜白眼病是由細菌感染引起，但未明確具體病原菌；楊瑞婷（2014）研究發現巴西龜白眼病的病原菌主要是革蘭氏陰性菌，與巴西龜腸道菌群檢出情況相似；李建華和胡大勝（2014）在對廣西擬水龜幼龜白眼病進行診斷時，確診其病原菌為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。【本研究切入點】實際生產發現，白眼病對12～30 g的稚龜有較強傳染性，病情發展迅速，若處理不當死亡率可達20%～50%，但至今除了趙忠添（2006）對黃喉擬水龜白眼病進行防治初探外，未見其他相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】對患白眼病的黃喉擬水龜進行無菌解剖和病原分離，經細菌培養特征、生理生化試驗、16S rDNA序列分析及動物致病性試驗鑒定其病原菌，并通過藥敏試驗分析病原菌的藥物敏感性，以期為黃喉擬水龜白眼病的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患白眼病黃喉擬水龜采自南寧市某龜鱉養殖場，健康黃喉擬水龜稚龜（10～30 g）由廣西水產科學研究院那馬基地提供，4周齡健康小白鼠購自廣西醫科大學實驗動物中心。普通瓊脂培養基、LB培養基在實驗室配制；血瓊脂培養基購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；微量生化反應管、藥敏紙片購自上海金穗生物科技有限公司；Ex-Taq、pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質粒回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 細菌分離培養及理化鑒定

無菌剖檢病龜，用接種環在其肝臟、肺臟、脾臟等組織上取樣接種于普通瓊脂培養基和血瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養18 h。挑選單個菌落接種于LB培養基，37 ℃純化培育16 h。純化的細菌經革蘭氏染色后，于顯微鏡下進行觀察，細菌鞭毛用硝酸鹽染色。同時對細菌進行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、M.R.、V-P、硫化氫、枸櫞酸鹽、吲哚、硝酸鹽、明膠、硫化氫、鳥氨酸脫羧酶、動力試驗等生理生化鑒定，具體操作參照東秀珠和蔡妙英（2001）的方法。

1. 3 動物試驗

將分離純化后的菌株接種于新鮮普通瓊脂培養基上，37 ℃培養16 h后用無菌生理鹽水進行稀釋，采用比濁法進行計數，將菌懸液稀釋為1×108 CFU/mL。選用4周齡健康小白鼠和健康黃喉擬水龜稚龜進行動物試驗，其中，小白鼠試驗分別設試驗組（15只）和對照組（15只），試驗組經小白鼠腹腔注射菌懸液100 μL/只，對照組腹腔注射等量生理鹽水；黃喉擬水龜試驗也設試驗組（9只）和對照組（9只），試驗組稚龜經腹腔注射菌懸液100 μL/只，對照組腹腔注射等量生理鹽水。試驗組和對照組動物在同一環境下養殖，每天觀察小白鼠和黃喉擬水龜的發病、死亡情況，連續觀察10 d，并對死亡的試驗動物進行剖檢和病原菌分離鑒定。

1. 4 16S rDNA序列分析

分離菌株經37 ℃搖床（200 r/min）培養16 h后，取1.5 mL于4 ℃下12000 r/min離心1 min，抽提細菌總DNA。PCR反應體系50.0 μL，其中10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物16S-F（5'-AGAGTTTGAT

CMTGGCTCAG-3'）1.0 μL，下游引物16S-R（5'-TACG

GYTACCTTGTTACGACTT-3'）1.0 μL，Ex-Taq 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 39.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min，預擴增片段1501 bp。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，經凝膠回收試劑盒純化回收后連接至pMD18-T載體，再轉化DH5α感受態細胞。挑選陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI中進行BLAST比對分析，并用MAGE 5.0構建系統發育進化樹。

1. 5 藥敏試驗

將分離純化的菌株涂布在普通瓊脂培養基上，然后分別貼上藥敏紙片，37 ℃恒溫培養24 h后測量各抗菌藥的抑菌圈直徑，評判分離菌株的藥物敏感性。

2 結果與分析

2. 1 黃喉擬水龜白眼病的臨床癥狀及其病理變化

黃喉擬水龜白眼病的臨床癥狀主要表現為眼睛發炎、腫大、充血，眼瞼黏膜糜爛、眼睛外表覆蓋黃白色分泌物（圖1）；病情嚴重時鼻子及嘴巴黏膜潰爛、不時有黏液流出，張口呼吸。其剖檢病理變化表現為肝臟有針狀出血、瘀血，嚴重時有大塊瘀血斑；肺部有積液、充血，或有較多氣泡，咽喉紅腫充血。

2. 2 分離菌株的形態學及生理生化鑒定結果

分離菌株在普通瓊脂培養基上生長成淺白色、透明、圓形凸起、邊緣光滑的菌落，菌落直徑0.4～1.5 mm。分離菌株為革蘭氏陰性桿菌，菌體兩端頓圓，呈單個或短鏈狀排列（圖2）。對分離菌株進行生理生化鑒定，結果顯示該菌表現為兼性厭氧、產酸、產氣、發酵型、無運動能力的革蘭氏陰性桿菌（表1），與肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的生理生化特性高度相似。

2. 3 分離菌株的動物致病性試驗結果

小白鼠人工感染試驗結果表明，小白鼠在注射接種菌懸液后10 h開始發病，24 h內全部死亡。黃喉擬水龜人工感染試驗結果表明，黃喉擬水龜在注射接種菌懸液后24 h開始發病，病龜表現出精神萎靡不振、反應遲頓、呼吸困難、眼部發炎充血等癥狀，從第2 d開始有病龜死亡，至第7 d試驗組黃喉擬水龜全部死亡；剖檢發現，其病理變化表現為肝臟腫脹、有出血點，脾臟腫大，肺臟充血水腫。對照組的小白鼠和黃喉擬水龜均未發病或死亡。從發病死亡小白鼠、黃喉擬水龜的肺臟和肝臟均能分離獲得與接種菌株一致的病原菌。

2. 4 分離菌的16S rDNA擴增及測序分析結果

PCR擴增分離菌株的16S rDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，擴增片段約1500 bp（圖3），與預期結果一致。將純化回收的目的片段送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，其GenBank登錄號為KU855372。將分離菌株的16S rDNA序列與GenBank已知菌株的16S rDNA進行比對，發現分離菌株與肺炎克雷伯菌的同源性最高，為99.1%。用MAGE 5.0構建基于16S rDNA序列的腸桿菌科及革蘭氏陰性菌系統發育進化樹，發現分離菌株與肺炎克雷伯菌同屬于一個群體（圖4），即確定分離菌株為肺炎克雷伯菌。

2. 5 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果表明，分離菌株對恩諾沙星、頭孢噻吩、頭孢噻肟、氧氟沙星等高度敏感，對多粘菌素、痢特靈、頭孢氨芐、慶大霉素、痢特靈、環丙沙星等中度敏感，對鏈霉素、新霉素、青霉素、卡那霉素、四環素、克林霉素、強力霉素、阿莫西林、復方新諾明等已產生耐藥性（表2）。

3 討論

肺炎克雷伯菌為革蘭氏陰性菌，隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌屬（Klebsiella），通常寄生于動物呼吸道和腸道內，對動物有強致病性（Brisse and Duijkeren，2005；賈艷等，2006）。目前，已從多種哺乳動物及水生動物中分離獲得肺炎克雷伯菌，其病理變化主要集中在肝臟、肺臟、呼吸道及腸道。徐海圣和舒妙安（2002）從患病中華鱉的病料中分離獲得肺炎克雷伯菌，其病理變化為全身浮腫、腹腔內有積液，肝臟呈花斑狀，肺部充血發黑。本研究從患白眼病黃喉擬水龜的肝臟、肺臟和脾臟中分離獲得一株優勢菌株，其培養特性、生理生化鑒定結果初步確定為肺炎克雷伯菌；將分離菌株的16S rDNA序列與肺炎克雷伯菌進行比對，發現二者的同源性為99.1%；由基于16S rDNA序列的腸桿菌科及革蘭氏陰性菌系統發育進化樹也發現分離菌株與肺炎克雷伯菌同屬于一個群體，即確定分離菌株為肺炎克雷伯菌。本研究剖檢發現患白眼病黃喉擬水龜的主要病理變化為肝臟、肺臟和呼吸道損傷，與趙忠添（2006）、李建華和胡大勝（2014）的剖檢結果相似，在病情嚴重時才表現出眼部感染發炎，即肺臟、肝臟受損才是患白眼病龜鱉死亡的主要原因。

本研究的藥敏試驗結果表明，從患白眼病黃喉擬水龜肝臟、肺臟及脾臟中分離獲得的肺炎克雷伯菌對鏈霉素、新霉素、青霉素、卡那霉素、四環素、克林霉素、強力霉素、阿莫西林、復方新諾明等已產生耐藥性，可能與肺炎克雷伯菌的廣泛耐藥性有密切關系。劉保光等（2014）研究表明，β-內酰胺類抗生素是治療肺炎克雷伯菌感染的有效藥物，但隨著β-內酰胺類抗生素在臨床治療中的大量應用，導致細菌產生β-內酰胺酶，致使肺炎克雷伯菌耐藥性逐年提高。林星宇等（2015）研究發現，豬源肺炎克雷伯菌對青霉素類及青霉素類復合制劑不敏感，且對部分頭孢類抗生素表現出低程度耐藥，表明其可能含有β-內酰胺酶，產生了耐藥性。因此，在黃喉擬水龜白眼病的防治中應引起高度重視，必須始終貫徹以防為主的指導思想，從正規良種場購買或引進優質種苗；養殖過程中注意環境衛生、控制養殖密度，采取仿生態養殖模式；治療時應根據藥敏試驗結果科學用藥，減少廣譜抗生素的使用，避免產生耐藥性。

4 結論

肺炎克雷伯菌是引起黃喉擬水龜白眼病的主要病原菌，生產中可選用恩諾沙星、氧氟沙星等沙星類或頭孢噻吩、頭孢噻肟等頭孢類藥物進行防治。

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（責任編輯 蘭宗寶）