三種江蘺共附生細菌多樣性及抑菌活性分析

覃媚 于清武 竺利波 李菲 顏棟美 余煉 高程海

摘要：【目的】研究廣西北部灣潿洲島海域3種江蘺可培養共附生細菌多樣性及其代謝產物的抑菌活性，為該海域海藻共附生細菌的開發利用及新型生物殺菌劑的研發提供參考依據。【方法】經稀釋涂布法后觀察分析3種江蘺共附生細菌的菌落形態及其分布，基于16S rRNA序列對江蘺共附生細菌的物種多樣性進行分析，并利用紙片擴散法對其抑菌活性進行初步篩選。【結果】從廣西北部灣潿洲島海域的江蘺、扁江蘺和集團江蘺中共分離獲得28株可培養的共附生菌株，隸屬于4門13科15屬（芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、弧菌屬、冷桿菌屬、交替單胞菌屬、假交替單胞菌屬、赤桿菌屬、副球菌屬、考克氏菌屬、微球菌屬、紅小梨形菌屬、Kytococcus sp.、Dermacoccus sp.、Maribacter sp.和Cobetia sp.）。有5株共附生菌株的代謝產物對番木瓜炭疽病原菌或荔枝炭疽病原病菌表現出較好的拮抗作用，其中，菌株GXS0044、GXS0017和GXS0035的代謝產物對荔枝炭疽病菌有較好的抑制作用（抑菌圈直徑分別為15.0、14.5和15.5 mm），菌株GXS0023和GXS0031的代謝產物則對番木瓜炭疽病菌有較好的抑制作用（抑菌圈直徑分別為15.0和17.0 mm）。【結論】廣西北部灣海域的江蘺共附生細菌較豐富，其代謝產物活性各不相同，因此從海藻中尋找具有抗農業病原菌的微生物將成為研究抗農業病原菌殺菌劑的新方向。

關鍵詞： 江蘺；16S rRNA；多樣性；抑菌活性；廣西北部灣

中圖分類號： S968.434 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1966-08

Abstract：【Objective】The present study was conducted to explore the diversity of culturable epiphytic bacteria of three species of Gracilaria and bacteriostatic activities of their metabolits in sea area around Weizhoudao Island， Beibu Gulf， Guangxi， in order to provide reference for development of these epiphytic bacteria in the sea area and new biological fungicides. 【Method】Dilution coating method was applied to observe colonial morphology and distribution of epiphytic bacteria of three species of Gracilaria. Diversity of the epiphytic bacteria of Gracilaria was analyzed based on 16S rRNA sequence and their bacteriostatic activities were screened by disc diffusion method. 【Result】Twenty-eight strains were extracted from Gracilaria verrucosa， Gracilaria textorii and Gracilaria glomerata in Beibu Gulf， Guangxi belonged to four subclasses， thirteen families and fifteen genuses（Bacillus sp.； Staphylococcus sp.； Vibrio sp.； Psychrobacter sp.； Alteromonas sp.；Pseudoalteromonas sp.； Erythrobacter sp.； Paracoccus sp.； Kocuria sp.； Micrococcus sp.； Rhodopirellula sp.； Kytococcus sp.； Dermacoccus sp.； Maribacter sp.； Cobetia sp.）. The metabolites of five strains showed obvious antagonistic effects against Colletrichum gloeosporiode M2 or C. gloeosporiodes Lz2. Metabolites of strains GXS0044， GXS0017 and GXS0035 showed sound inhibition effects towards C. gloeosporiodes Lz2（antibacterial circle diameters were 15.0， 14.5 and 15.5 mm， respectively）. Metabolites of strains GXS0023 and GXS0031 showed obvious inhibition effects towards C. gloeosporiode M2（antibacterial circle diameters were 15.0 and 17.0 mm， respectively）. 【Conclusion】There are resourceful epiphytic bacteria of Gracilaria and their metabolites activities are different. Therefore， searching for pathogens that are resistant to agricultural diseases from seaweeds will become a new direction in development of new pathogen fungicides that against agricultural diseases.

Key words： Gracilaria； 16S rRNA； diversity； bacteriostatic activity； Beibu Gulf in Guangxi

0 引言

【研究意義】番木瓜和荔枝均屬熱帶亞熱帶水果，其食味鮮美、營養豐富，深受消費者喜愛，但二者又屬于呼吸躍變型果實，采后不耐貯藏、運輸，其中番木瓜炭疽病菌（Colletrichum gloeosporiode M2）和荔枝炭疽病菌（C. gloeosporiodes Lz2）是引起番木瓜和荔枝采后腐爛的主要病原菌（張傳飛和戚佩坤，1994；劉愛媛等，2003）。目前，主要使用百菌清、嘧菌酯等化學殺菌劑對番木瓜炭疽病原菌和荔枝炭疽病原菌進行防治（彭埃天等，2011），但易造成水果污染和農藥殘留，影響消費者健康。因此，研發低毒、高效、環境友好型的生物殺菌劑迫在眉睫。【前人研究進展】藻類在生長過程中會向周邊環境釋放大量的有機物質，使藻細胞周圍形成一個獨特的微環境，稱為藻際微環境。藻際微環境中存在大量細菌，這些細菌具有獨特的結構與功能，與藻細胞共同構成復雜的生態關系（李云冰等，2011）。已有研究表明，藻際微環境中的細菌會影響藻體的附著與變態（張朝霞等，2005），同時影響藻體分泌物質的生成（Hirmas，2008），其中許多海洋活性物質都是由海藻共附生菌分泌產生（Jensen and Fenical，1994；繆輝南和戴建涼，1995）。Manuel等（1985）從5種綠藻和棕藻中分離出224株菌種，經抗生素測試，結果顯示有38株具有抗生素活性。馬悅欣等（2003）報道，海藻的某些共附生菌對蝦源熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescence）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和費氏弧菌（Vibrio fischei）均具有良好的抑制作用。卜蒙蒙（2015）從海藻樣品表面分離獲得153株菌株，并利用瓊脂塊法對其進行抑菌活性檢測，結果發現其中有3株菌株對金色葡萄球菌有良好的抑制作用，有1株菌株對大腸桿菌有較好的抑制作用。因此，有望從海藻共附生細菌中分離篩選出具有抗番木瓜炭疽病菌和荔枝炭疽病菌活性的海洋細菌，進而研發出基于海洋細菌的生物殺菌劑，以促進我國水果行業的健康發展。【本研究切入點】廣西北部灣海域地處亞熱帶，是大型經濟藻類江蘺的主產區，但至今有關廣西北部灣海域海藻共附生細菌方面的研究報道較少，而針對抗番木瓜炭疽病菌和荔枝炭疽病菌的海洋細菌研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】對廣西北部灣潿洲島海域的江蘺（Gracilaria verrucosa）、扁江蘺（G. textorii）和集團江蘺（G. glomerata）3種海藻可培養的共附生細菌進行多樣性分析，并對其代謝產物的抑菌活性進行初步篩選，以期為廣西北部灣海域海藻共附生細菌的開發利用及新型生物殺菌劑的研發提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

3種江蘺樣品均采自廣西北海潿洲島石螺口海域（東經109°5′～109°13′，北緯20°54′～21°5′），番木瓜炭疽病菌和荔枝炭疽病菌購自北京北納創聯生物技術研究院，Marine agar 2216、Trehalose-Aspartic Acid（M4）、改良Gause No.1（M6）和ISP2等培養基購自南寧藍天實驗設備有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株分離純化 取3種江蘺樣品各約2.0 g，無菌水沖洗表面3次后于植物勻漿器中研磨，將研磨好的樣品轉移至250 mL錐形瓶中，加入80 mL無菌海水，置入28 ℃恒溫培養箱中振蕩（140 r/min）培養48 h，然后分別取3種混合液制備成10-5～10-1不同梯度的稀釋液，吸取各梯度稀釋液200 μL涂布于4種培養基上，3次重復，28 ℃下培養5～7 d后進行菌株計數和分離純化。分離純化的菌株用已滅菌牛奶管保藏于-80 ℃超低溫冰箱，或制成20%（w/v）甘油管保藏于-80 ℃超低溫冰箱。

1. 2. 2 PCR擴增和系統發育進化樹構建 菌株DNA提取和16S rRNA序列擴增均參照滕松山（2010）的方法，采用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT

CA-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR擴增程序：94 ℃預變性8 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，然后將陽性擴增產物送至北京華大基因研究中心測序。將測序結果在GenBank中進行BLAST同源性搜索及ClustalX多重比對，并采用MEGA 5.0中的Neighbor-Joining法構建系統發育進化樹，各分支的置信區間值均進行Boostrap 1000次檢測。

1. 2. 3 菌株發酵及次級代謝產物提取 菌種培養基和發酵培養基均采用ISP2液體培養基。取適量菌種接種至裝有80 mL液體培養基的250 mL三角瓶中作為菌種培養液，并置于28 ℃恒溫培養箱中振蕩（140 r/min）培養7 d，然后將每株菌株的菌種培養液分別接入經121 ℃滅菌且裝有160 mL液體培養基的500 mL三角瓶中再培養7 d，每株菌株5個重復。發酵得到的菌株培養液用細胞破碎儀進行破碎、乙酸乙酯萃取、旋轉蒸發儀濃縮，得到的浸膏即為次級代謝產物供試樣品。

1. 2. 4 抗菌活性試驗 用二甲基亞砜（DMSO）溶液分別將分離鑒定的各菌株次級代謝產物供試樣品溶解，配制成5 mg/mL的溶液，取5.0 μL滴加到直徑6 mm的濾紙片上，然后將濾紙片分別置于已接入荔枝炭疽病菌和番木瓜炭疽病菌的培養基上。以5 mg/mL百菌清為陽性對照，DMSO溶液為空白對照。經37 ℃培養48 h后采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，每個樣品3次重復。

2 結果與分析

2. 1 菌株分離鑒定結果

從采集的江蘺、扁江蘺和集團江蘺樣品中共分離獲得34株共附生菌株，經PCR擴增各菌株16S rRNA序列、測序及采用BLAST進行同源性比對，結果發現34株菌株中包含6株重復菌株。28株不同的共附生細菌分屬于4門13科15屬（芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、弧菌屬、冷桿菌屬、交替單胞菌屬、假交替單胞菌屬、赤桿菌屬、副球菌屬、考克氏菌屬、微球菌屬、紅小梨形菌屬、Kytococcus sp.、Dermacoccus sp.、Maribacter sp.和Cobetia sp.）。其中，從江蘺中分離獲得10株共附生細菌，從扁江蘺中分離獲得14株共附生細菌，從集團江蘺中分離獲得10株共附生細菌（表1）。由表1可知，江蘺、扁江蘺和集團江蘺兩兩之間存在相同的共附生細菌，江蘺與扁江蘺存在1株相同的共附生細菌Psychrobacter celer（GXS0038），江蘺與集團江蘺存在2株相同的共附生細菌Staphylococcus warneri（GXS0045）和Maribacter dokdonensis（GXS0017），扁江蘺與集團江蘺存在3株相同的共附生細菌Alteromonas australica（GXS0022）、A. macleodii（GXS0024）和Cobetia marina（GXS0016）。

同時，在屬級水平上對3種江蘺共附生細菌進行Venny分析，結果如圖1所示。江蘺與扁江蘺存在1個共有菌屬（Psychrobacter sp.），江蘺與集團江蘺存在2個共有菌屬（Staphylococcus sp.和Maribacter sp.），扁江蘺與集團江蘺存在2個共有菌屬（Alteromonasspgttg sp.和Cobetia sp.）。3種江蘺存在相同的種或屬，是由于3種江蘺同屬于紅藻門（Rhodophyta）江蘺科（Gracila-

riaceae）江蘺屬（Gracilaria），其生理生化特性存在一些相似性，而且這些樣品采自同一海域，故其共附生菌具有相似性。從圖1還可看出，從江蘺中共分離獲得6個屬，扁江蘺中共分離獲得9個屬，集團江蘺中共分離獲得5個屬，即扁江蘺較江蘺和集團江蘺藻際微環境復雜，可培養的共附生細菌多樣性相對較豐富。

2. 2 菌株系統發育進化分析結果

基于16S rRNA序列對所分離獲得的菌株進行系統發育進行分析，結果表明，從江蘺、扁江蘺和集團江蘺中分離獲得的28株菌株分布在四大類群，分別為α-變形菌綱、γ-變形菌綱、放線菌門和厚壁菌門。從江蘺共附生細菌系統發育進化樹（圖2）可看出，菌株GXS0044、GXS0023和GXS0031的親緣關系較近，均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）；菌株GXS0026、GXS0045和GXS0046的親緣關系較近，均屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）。從扁江蘺共附生細菌系統發育進化樹（圖3）可看出，菌株GXS0022、GXS0042、GXS0028和GXS0024的親緣關系較近，均屬于交替單胞菌屬（Alteromonas sp.），且菌株GXS0022和GXS0042的關系更近。從集團江蘺共附生細菌系統發育進化樹（圖4）可看出，菌株GXS0009、GXS0051和GXS0045的親緣關系較近，均屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）；菌株GXS0037和GXS0052的親緣關系較近，均屬于赤桿菌屬（Erythrobacter sp.）；菌株GXS0016和GXS0025的親緣關系較近，均屬于Cobetia sp.。

2. 3 共附生菌活性的初步篩選結果

將從江蘺、扁江蘺和集團江蘺分離獲得的28株菌株分別用番木瓜炭疽病菌、荔枝炭疽病菌進行初步的活性篩選試驗，結果發現有5株共附生菌株的代謝產物對番木瓜炭疽病菌或荔枝炭疽病菌表現出較強的拮抗作用（表2）。其中，菌株GXS0044、GXS0017和GXS0035的代謝產物對荔枝炭疽病菌有較好的抑制作用（抑菌圈直徑分別為15.0、14.5和15.5 mm），菌株GXS0023和GXS0031的代謝產物則對番木瓜炭疽病菌有較好的抑制作用（抑菌圈直徑分別為15.0和17.0 mm）。

3 討論

目前，國內外有關海藻的研究偏重于其營養價值（葉靜等，2010）、加工工藝（吳湛霞等，2010）及化學成分分析（夏歡等，2015），針對其共附生細菌的研究報道較少。但已有大量研究表明，許多海洋活性物質都是由海藻共附生菌分泌產生，海藻共附生菌是個潛在的資源庫（Jensen and Fenical，1994；Burgess et al.，1999；孫杰等，2007；趙婷婷等，2009；楊瑞云等，2010）。海藻與其共附生細菌間存在物質交流（Manuel et al.，1985；Bansemir et al.，2006），海藻的分泌物與共附生細菌多樣性密切相關，使其演變出獨特的種類或產生特殊的代謝活性物質，進而維護、改善和調節整個水域的生態系統平衡。同樣，這些共附生細菌又會影響海藻生長和分泌。趙銳等（2013）研究發現，某些海藻共附生細菌會通過吸收藻類的營養物質，經過代謝后以礦物質或其他形式回饋藻體或釋放入海水環境中，或是產生影響海藻葉片正常生長發育的代謝物質。本研究對廣西北部灣潿洲島石螺口海域的3種江蘺共附生細菌進行分離鑒定，分離獲得的菌株隸屬于4門13科15屬，表明江蘺中確實存在較豐富的共附生細菌。通過對比江蘺、扁江蘺和集團江蘺的共附生細菌，發現不同種類江蘺間存在一些相同的細菌，是由于3種江蘺同屬于紅藻門（Rhodophyta）江蘺科（Gracilariaceae）江蘺屬（Gracilaria），其生理生化特性存在一些相似性，而且這些樣品采自同一海域，故其共附生細菌具有相似性。

本研究結果還表明，菌株GXS0044、GXS0017和GXS0035的代謝產物對荔枝炭疽病菌有較好的抑制作用，菌株GXS0023和GXS0031的代謝產物則對番木瓜炭疽病菌有較好的抑制作用。其中，菌株GXS0044、GXS0023和GXS0031均為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。已有研究證實，芽孢桿菌種群中包含許多具有特殊功能的菌株，如具有抑制多種植物病原菌的能力（劉國紅等，2008；陳蕾等，2011；毛濤等，2014），本研究結論進一步佐證了這一觀點。芽孢桿菌屬是廣泛存在于自然界中的一類細菌，無致病性，對人畜及生態環境均不存在危害性。截至2014年12月，我國已有5種生防芽孢桿菌類生物殺菌劑完成農藥登記，共有59個產品（唐容容等，2013；張榮勝等，2014）。由于生防芽孢桿菌生物殺菌劑對人畜安全，無農藥殘留和抗藥風險，對環境友好，是農藥未來的發展方向。朱鵬等（2010）研究報道，微小卡羅藻的共附生微生物W-4（Maribacter dokdonensis）對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母和銅綠假單孢菌均有不同程度的抑制作用；劉陽等（2013）研究發現，從東山灣軟珊瑚共附生菌中分離獲得的Maribacter dokdonensis IA07679可產蛋白酶和酯酶；Gao等（2014）研究發現，Kytococcus sedentarius具有抑制藤壺幼蟲的活性。因此，下一步將對抗菌活性較好的菌株培養條件進行優化，并研究其抑制農業病原菌的機理，以期為新型抗農業病原菌殺菌劑的研發提供參考依據，進而拓寬生防芽孢桿菌類殺菌劑的應用范圍。

4 結論

廣西北部灣海域的江蘺共附生細菌較豐富，其代謝產物活性各不相同，因此從海藻中尋找具有抗農業病原菌的微生物將成為研究抗農業病原菌殺菌劑的新方向。

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（責任編輯 蘭宗寶）