長葉竹柏次生代謝產物及其抗細菌活性

伍慧雄 秦楷 張偉豪 羅元嘉 孫朝輝 王軍 單體江

摘要：【目的】分析和鑒定長葉竹柏葉片和枝條揮發油的化學組成，測定長葉竹柏葉片和枝條揮發油及其甲醇提取物對7種供試細菌的抑制活性，為長葉竹柏資源的開發利用提供參考。【方法】采用水蒸氣蒸餾法分別提取長葉竹柏葉片和枝條的揮發油，通過氣相色譜—質譜聯用儀（GC-MS）對提取得到的揮發油進行化學成分分析，采用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對百分含量，并以抑菌圈法和薄層層析—生物自顯影法分別測定長葉竹柏枝葉揮發油和甲醇提取物對供試細菌的抑制活性。【結果】長葉竹柏葉片和枝條揮發油的得率分別為0.104%和0.078%。從長葉竹柏葉片揮發油中鑒定出45種成分，占揮發性成分總量的92.63%，主要成分為（1R）-α-蒎烯（34.50%）、大根香葉烯B（22.82%）、大根香葉烯D（5.46%）、綠花烯（4.74%）和α-古蕓烯（3.15%）；從長葉竹柏枝條揮發油中鑒定出44種成分，占揮發性成分總量的95.51%，主要成分為（1R）-α-蒎烯（43.86%）、δ-杜松烯（7.93%）、1-石竹烯（4.92%）、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1H-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）、古巴烯（3.68%）、γ-杜松烯（3.60%）和蒜頭環烯（3.04%）。長葉竹柏葉片和枝條揮發油對供試細菌表現出一定的抑制活性，但差異不明顯；長葉竹柏葉片揮發油對根癌土壤桿菌的抑制活性最強，抑菌圈直徑為9.0±0.0 mm，而枝條揮發油對溶血葡萄球菌和黃瓜角斑病菌的抑制活性最強，抑菌圈直徑均為8.3±0.6 mm。除桉樹青枯病菌外，長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物對其余6種供試細菌均表現出較好的抑制活性，其中葉片甲醇提取物對供試細菌的抑制活性強于枝條。【結論】長葉竹柏葉片和枝條中的抗菌活性物質主要為非揮發性的物質，可作為天然抗菌活性物質資源開發利用。

關鍵詞： 長葉竹柏；揮發油；化學成分；GC-MS；抗菌活性

中圖分類號： S482.2；S791.46 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1867-08

Abstract：【Objective】The present study was conducted to analyze and identify the chemical composition of the volatile oils extracted in leaves and branches of Podocarpus fleuryi Hickel. The antibacterial activities of the volatile oils and methanol extracts were tested against seven different bacteria. This study would provide the potential foundation for the development and utilization of P. fleuryi resources. 【Method】The volatile oils were extracted by hydro-distillation from leaves and branches of P. fleuryi and the chemical compositions of the essential oil were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. The relative percentages of different chemical components were measured by peak area normalization. Inhibition zone method and TLC-MTT-bioautography were used to detect the inhibitory activities of volatile oils extracted from leaves and branches of P. fleuryi and methanol extracts against the tested bacteria. 【Result】The yields of volatile oils in leaves and branches were 0.104% and 0.078%， respectively. Forty-five components were identified from the volatile oils in leaves， accounting for 92.63% of total volatile components. The major constituents included（1R）-α-pinene（34.50%）， germacrene B（22.82%）， germacrene D（5.46%）， viridiflorene（4.74%） and α-gurjunene（3.15%）. Forty-four components were identified from the volatile oils in branches， accounting for 95.51% of total volatile components. The major constituents included（1R）-α-pinene（43.86%）， δ-cadinene（7.93%）， l-caryophyllene（4.92%），（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1H-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）， 2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）， copaene（3.68%）， γ-cadinene（3.60%） and cyclosativene（3.04%）. The volatile oils in leaves and branches showed certain inhibitory activities to the tested bacteria， but the differences were not obvious. The volatile oil in leaves showed the strongest inhibitory activity against Agrobacterium tumefaciens and the inhibition zone diameter was 9.0±0.0 mm. While the branches volatile oil showed strongest inhibitory activities against Staphylococcus haemolyticus and Pseudomonas syringae， and inhibition zone diameters were both 8.3±0.6 mm. The methanol extracts from the leaves and branches showed sound inhibitory activity to the tested bacteria except for Ralstonia solanacearum， and the inhibitory activities of methanol extracts from leaves was stronger than that of methanol extracts from branches. 【Conclusion】The antibacterial substances in leaves and branches of P. fleuryi Hickel are mainly non-volatile substances， and can be developed as natural antibacterial substance resources.

Key words： Podocarpus fleuryi Hickel； volatile oil； chemical constituent； GC-MS； antibacterial activity

0 引言

【研究意義】長葉竹柏（Podocarpus fleuryi Hickel）為羅漢松科竹柏屬常綠喬木，又名桐木樹、竹葉球等，生于海拔800～900 m的山地林中，主要分布于我國的云南東南部、廣西、廣東、海南和臺灣等地。其木材結構致密，為上等的家具、建筑用材；種子含油較豐富，經濟價值較高；樹形優美，常作行道樹及園林綠化樹種（何道航等，2005； 張蘭春，2013）。長葉竹柏作為常見的園林綠化樹種很少受病蟲為害，是否與自身產生的抗菌活性物質有關值得深入研究和探討。【前人研究進展】目前，國內外有關長葉竹柏的研究較少且主要集中于葉片化合物成分和植株抗逆研究（齊代華等，2003a， 2003b）。徐亞明等（1990）根據理化性質和波譜學方法從長葉竹柏枝葉中鑒定出棕擱酸、柳杉酚等11種成分，但未給出相關數據。何道航等（2005）采用水蒸氣蒸餾法提取長葉竹柏葉片中的揮發油，通過氣相色譜—質譜聯用儀（GC-MS）分析，共鑒定出24種化合物，其中主要成分為4-isopropylidene-1-vinyl-o-

Menth-8-ene（45.13%）、大根香葉烯（21.56%）、α-蒎烯（8.67%）、β-石竹烯（3.97%）、（-）-斯巴醇（3.15%）、（-）-β-欖香烯（2.68%）、（+）-喇叭烯（2.11%）和β-杜松烯（2.02%）。杜紅光（2008）采用水蒸氣蒸餾法分別提取竹柏和長葉竹柏葉片中的揮發油，通過GC-MS分析，分別鑒定出13和29種化合物，主要成分為萜烯類和醇類物質，但兩者揮發油GC-MS分析圖譜和成分存在明顯差異。劉娟（2015）對云南西雙版納的長葉竹柏葉片和枝干的化學成分進行分離和鑒定，共分離鑒定獲得39種化合物，其中2種為新的甾體化合物；對分離獲得到的新甾體類化合物進行了細胞毒活性研究，但未表現出活性。目前已有長葉竹柏同屬植物竹柏葉片及枝條中揮發油的相關研究報道。胡文杰等（2014）用水蒸氣蒸餾法和GC-MS分析對竹柏葉片及其枝條中揮發油進行分析，從竹柏葉片和枝條揮發油中各檢測出36 和43種成分，共檢測出52種物質；竹柏葉片及其枝條揮發油中共有成分27種，但相對含量不同，如葉片中α-蒎烯含量為3.89%，而在枝條中的含量為20.77%。【本研究切入點】長葉竹柏資源豐富，但尚未見其不同部位揮發油化學成分分析及其抗細菌活性的報道。【擬解決的關鍵問題】采用水蒸氣蒸餾法提取長葉竹柏葉片和枝條中的揮發油，運用GC-MS分析其揮發油的化學組成并通過抑菌圈法測定其抗細菌活性，以確定長葉竹柏不同部位揮發油的化學成分及相對含量，并探索其抑菌活性；采用薄層層析—生物自顯影法（TLC-生物自顯影）分別測定長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物對供試細菌的抑制活性，以期為長葉竹柏在農林業上的應用提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

長葉竹柏枝條和葉片于2014年7月18日采自華南農業大學樹木園，植株生長狀態良好，無病蟲為害。標本由華南農業大學林學與風景園林學院鄭明軒老師鑒定。供試細菌包括5種革蘭氏陰性菌和2種革蘭氏陽性菌，分別為根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens，G-）、大腸桿菌（Escherichia coli，G-）、桉樹青枯病菌（Ralstonia solanacearum，G-）、黃瓜角斑病菌（Pseudomonas lachrymans，G-）、番茄瘡痂病菌（Xantho-

monas vesicatoria，G-）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，G+）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，G+），均由華南農業大學林學與風景園林學院森林保護教研室提供。

主要試劑：硫酸鏈霉素（美國Sigma公司）；C8～C40系列正構烷烴（美國Sigma公司）；噻唑蘭（MTT）（美國Amresco公司）；氯化鈉、無水乙醚、無水硫酸鈉、正己烷等均為國產分析純（北京化學試劑公司）。主要儀器設備：6890N-5975C氣相色譜—質譜聯用儀（GC-MS）（美國安捷倫科技有限公司）；水蒸氣蒸餾裝置（北京永光明醫療儀器廠）；RE5298A型旋轉蒸發器（上海亞榮儀器廠）等。

1. 2 長葉竹柏揮發油提取

參照Lou等（2014）的方法并作適當修改。分別采集長葉竹柏的葉片和枝條，剪碎、稱重后裝入水蒸氣蒸餾裝置內，加入適量蒸餾水，待溫度升至100 ℃后連續蒸餾6 h，收集蒸出的精油，加入一定量的NaCl，用無水乙醚萃取3次，萃取液合并，加入無水硫酸鈉進行干燥，讓乙醚自然揮發，4 ℃密封保存。

1. 3 長葉竹柏葉片和枝條揮發油化學組分分析

長葉竹柏葉片和枝條揮發油化學組分鑒定在6890N-5975C GC-MS上進行，色譜柱為DB-5（30 m×250 μm×0.25 μm），無分流進樣，進樣口溫度230 ℃，進樣量1 μL。升溫程序：起始溫度70 ℃，保持1 min；8 ℃/min上升到120 ℃，保持1 min；30 ℃/min上升到150 ℃，保持1 min；5 ℃/min上升到175 ℃，保持0 min；1 ℃/min上升到180 ℃，保持0 min；5 ℃/min上升到240 ℃，保持0 min。電離方式為EI，電離能量70 eV，載氣為He，流速1 mL/min，全掃描采集，質譜檢測器（MSD）檢測。通過NIST（2011）譜庫檢索，與標準化合物的保留時間和質譜圖進行比對，確定待測成分。

1. 4 長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物制備

采用甲醇冷浸提取法分別提取長葉竹柏葉片和枝條中的次生代謝產物。分別將長葉竹柏的葉片和枝條剪碎，裝入1000 mL三角瓶中，加入適量甲醇，室溫下冷浸提取3次，每次7 d，濃縮提取液，水混懸后用乙酸乙酯連續萃取3次，濃縮萃取液即得到長葉竹柏葉片和枝條的甲醇提取物，4 ℃冷藏，備用。

1. 5 長葉竹柏次生代謝產物抗細菌活性測定

1. 5. 1 長葉竹柏葉片和枝條揮發油抗細菌活性測定 長葉竹柏葉片和枝條揮發油抗細菌活性測定參照趙文越等（2014）的方法并略有改進。供試細菌先用LB 培養基活化培養（28 ℃，暗）48 h，然后挑取單菌落在LB液體培養基中搖床培養（28 ℃，暗，150 r/min）24 h，將菌液濃度稀釋至108 CFU/mL，備用。倒好培養基后，用移液槍分別吸取50 μL菌液，用玻璃棒涂抹均勻。用滅菌鑷子夾取無菌的濾紙片放在培養皿中，每皿放置3片，濾紙片間保持一定距離，然后分別在濾紙片上加入5 μL揮發油，陽性對照為5 μL硫酸鏈霉素（0.2 mg/mL），每處理3次重復。在黑暗條件下培養24 h后用尺子量取抑菌圈直徑。

1. 5. 2 長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物抗細菌活性測定 長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物抗細菌活性測定參照Shan等（2012）的方法。將甲醇提取物溶解，用直徑0.5 mm的毛細管點樣，點樣量為5 μL。采用二氯甲烷和甲醇作為展開劑進行薄層層析，薄層層析后在薄層板的一側原點處點5 μL硫酸鏈霉素（0.2 mg/mL）作陽性對照，備用。向滅菌的LB半固體培養基（瓊脂濃度為0.5%）中加入一定量準備好的菌液（45 mL LB+5 mL菌液），將其濃度調至約108 CFU/mL，振蕩、均勻。用噴樣器將制備好的菌懸液均勻噴灑到層析后的硅膠板上；待培養基在硅膠板上冷卻后，將硅膠板置于培養皿中于4 ℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的擴散；然后將培養皿置于28 ℃下保濕培養，12 h后取出硅膠板，在其上均勻噴灑噻唑藍（MTT），約10 min后即可觀察試驗結果。有抗菌活性成分處，供試菌由于受到抑菌成分的抑制而出現抑菌斑；無抗菌活性成分處，供試菌正常生長，通過MTT顯色后出現背景色藍色。通過抗菌斑點的遷移率（Rf）初步評價樣品中抗菌化合物的數量和極性，根據抗菌斑點的大小初步評價化合物的活性和含量

Rf=■

2 結果與分析

2. 1 長葉竹柏葉片和枝條揮發油化學成分分析結果

采用水蒸氣蒸餾法提取長葉竹柏葉片和枝條中的揮發油，得率分別為0.104%和0.078%（以鮮重為基礎），說明長葉竹柏葉片中揮發油的含量遠高于枝條。采用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，并對相對百分含量進行定量分析，結果見表1。長葉竹柏葉片和枝條揮發油總離子流圖見圖1和圖2。通過GC-MS分析發現，長葉竹柏葉片和枝條揮發油在化學組成和相對含量上均存在明顯差異。從長葉竹柏葉片中共鑒定出45種成分，占總相對含量的92.63%，主要成分是（1R）-α-蒎烯（34.50%）、大根香葉烯B（22.82%）、大根香葉烯D（5.46%）、綠花烯（4.74%）和α-古蕓烯（3.15%），其相對含量之和為70.67%，其他成分相對含量均小于3.00%；在枝條中共鑒定出44種成分，占總相對含量的95.51%，其中主要成分是（1R）-α-蒎烯（43.86%）、δ-杜松烯（7.93%）、1-石竹烯（4.92%）、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（pro-

pan-2-yl）octahydro-1h-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）、古巴烯（3.68%）、γ-杜松烯（-）-γ-蓽澄茄烯（3.60%）和蒜頭環烯（3.04%），其相對含量之和為75.66%；其他成分相對含量均小于3.00%。

從表1可進一步看出，長葉竹柏葉片和枝條揮發油主要以萜烯類和醇類為主，二者的主要成分均為（1R）-α-蒎烯，其相對含量分別為34.50%和43.86%，（1R）-α-蒎烯在枝條中的相對含量比葉片高9.36%（絕對值）。此外，大根香葉烯B和大根香葉烯D在葉片揮發油中的相對含量高達22.82%和5.46%，但在枝條中未檢測到；1-石竹烯、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene、古巴烯、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-

methyl-＼3-methy-lidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1h-

cyclopenta[1，3]、cyclopropa[1，2]benzene和蒜頭環烯作為枝條揮發油的主要成分，在葉片中也未檢測到。除（1R）-α-蒎烯外，長葉竹柏葉片和枝條揮發油中相同的成分還有11種，分別為1-辛烯-3-醇、β-水芹烯、α-古蕓烯、α-石竹烯、綠花烯、γ-杜松烯、β-杜松烯、δ-杜松烯、naphthalene，1，2，3，4，4a，7-hexahydro-1，6-dimethyl-

4-（1-methylethyl）-、阿松香三烯和鐵銹羅漢柏醇，但α-古蕓烯、綠花烯和δ-杜松烯在葉片和枝條揮發油中的相對含量差別較明顯。

通過以上分析可知，長葉竹柏葉片和枝條中均含有一定量的揮發油，雖然相對含量最高的成分均為（1R）-α-蒎烯，但不同部位的化學組成存在一定差異，因此要根據不同的需求，采集不同的部位進行提取。

2. 2 長葉竹柏次生代謝產物的抗細菌活性

2. 2. 1 長葉竹柏葉片和枝條揮發油的抗細菌活性 長葉竹柏葉片和枝條揮發油對7種供試細菌的抑制活性見圖3。從圖3可看出，長葉竹柏葉片和枝條揮發油對不同供試細菌的抑制活性差異不明顯，但均弱于陽性對照硫酸鏈霉素，其中葉片揮發油對根癌土壤桿菌的抑制活性最強，抑菌圈直徑為9.0±0.0 mm，而枝條揮發油對溶血葡萄球菌和黃瓜角斑病菌的抑制活性最強，抑菌圈直徑均為8.3±0.6 mm。長葉竹柏葉片和枝條揮發油對大腸桿菌均未表現出任何抗菌活性。活性測定結果表明長葉竹柏葉片和枝條揮發油對革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑制活性無明顯規律性。

2 .2. 2 長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物的抗細菌活性 通過TLC-生物自顯影法測定長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物的抗細菌活性，結果見表2。從表2可以看出，陽性對照硫酸鏈霉素對7種供試細菌的抑制活性與抑菌圈法測定的結果基本一致，對根癌土壤桿菌、番茄瘡痂病菌和溶血葡萄球菌的抑制活性最強，抑菌圈直徑均大于10 mm。長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物除對桉樹青枯病菌在Rf為0.00～1.00的范圍內均未表現出抑菌活性外，對其余6種供試細菌均表現出較好的抑制活性，其中葉片甲醇提取物對供試細菌的抑制活性強于枝條。長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物對供試細菌的最大抑菌斑直徑均在5～10 mm，但葉片甲醇提取物的抑菌斑多于枝條。以對根癌土壤桿菌的抑制活性為例，長葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物在Rf為0.00～0.25的范圍內均表現出抑制活性，葉片提取物在Rf為0.62～0.63的范圍內表現出較弱的抑制活性，枝條在Rf為0.60～0.67的范圍內也表現出相應的抑制活性；而葉片提取物在Rf為0.28～0.30和0.33～0.38的范圍內抑菌斑直徑在0～5 mm，枝條提取物在此范圍內未表現出抑制活性。長葉竹柏葉片甲醇提取物對枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌和大腸桿菌的抑制活性與對根癌土壤桿菌的抑制活性一樣，明顯強于枝條甲醇提取物；對番茄瘡痂病菌和黃瓜角斑病菌的抑制活性幾乎與枝條提取物一致。綜上所述，長葉竹柏的甲醇提取物對供試細菌具有一定的抑制活性，且葉片提取物的抑制活性強于枝條提取物。

3 討論

自何道航等（2005）首次從長葉竹柏葉片揮發油中鑒定出24種成分以來，尚未見長葉竹柏枝條揮發油化學成分分析及長葉竹柏揮發油抗細菌活性的報道。本研究采用水蒸氣蒸餾法分別提取長葉竹柏葉片和枝條中的揮發油，利用GC-MS從葉片揮發油中鑒定出45種成分，從枝條揮發油中鑒定出44種成分，首次闡明了長葉竹柏枝條揮發油的化學組成及其相對含量。長葉竹柏葉片和枝條揮發油雖然在化學組成和相對含量上存在明顯差異，但最主要的成分均為（1R）-α-蒎烯，其在葉片和枝條中的相對含量分別為34.50%和43.86%。而何道航等（2005）用水蒸氣蒸餾法提取長葉竹柏葉片中的揮發油，通過GC-MS分析共鑒定出24種化合物，其中主要成分為4-isopropylidene-1-vinyl-o-

Menth-8-ene（45.13%）和大根香葉烯（21.56%）等，α-蒎烯的相對含量僅占8.67%，低于本研究的34.50%，原因可能與植物生長的地理環境、采集時間以及提取和純化方法等不同有關。胡文杰等（2014）研究發現竹柏葉片揮發油的主要成分為欖香烯（20.85%）、β-蓽澄茄油烯（15.50%）、3-崖柏烯（8.61%）和α-石竹烯（5.86%），而竹柏枝條揮發油的主要成分為α-蒎烯（20.77%）、大根香葉烯B（15.12%）、石竹烯（9.30%）、β-蓽澄茄油烯（8.07%）和δ-杜松烯（5.48%）。長葉竹柏和竹柏雖然同屬于羅漢松科竹柏屬，但揮發油的化學組成和相對含量差別較大。

長葉竹柏葉片揮發油中含量最多的α-蒎烯能合成樟腦酸酐和樟腦醌，具有殺蟲和抑菌活性，也是許多種植物精油活性成分的重要組成部分（梁志華等，2013a，2013b；林立等，2015；吳恒等，2015）。α-蒎烯對白色念珠菌的生物合成有顯著的抑制作用，其通過抑制白色念珠菌細胞膜中麥角固醇、胞壁中幾丁質、多糖的合成及抑制核酸DNA、RNA 的合成而起到殺菌作用（夏忠弟和余俊龍，2000）。本研究首次報道了長葉竹柏葉片和枝條揮發油對不同供試細菌的抑制活性，結果表明，長葉竹柏枝葉揮發油對供試細菌的抑制活性不強，而長葉竹柏葉片和枝條的甲醇提取物表現出相對較強的抑制活性，可能與葉片和枝條中產生的非揮發性抗菌活性物質有關。徐亞明等（1990）、徐亞明和方圣鼎（1991）從長葉竹柏枝葉非揮發性成分中分離得到12種化合物，并經藥理篩選試驗發現有2個雙內酯化合物對白血病細胞P388有顯著的抑制作用；張春蘭（2013）從云南西雙版納的長葉竹柏中分離得到具有較強細胞毒作用的二萜雙內酯類化合物；但尚未見這些分離到的單體化合物對細菌抑制活性的報道。本研究結果表明，長葉竹柏枝葉甲醇提取物中確實存在抗菌活性化合物，這些抗菌物質是否為前人已分離到的單體化合物有待進一步研究。TLC-生物自顯影法不僅可以快速靈敏地檢測植物粗提物中的抗菌活性物質，還能通過薄層層析和Rf大小可對抗菌活性化合物的數目和極性有一定了解。

4 結論

長葉竹柏葉片和枝條中均含有種類豐富的揮發油，主要以萜烯類和醇類為主，其中葉片揮發油的含量高于枝條；除桉樹青枯病菌外，長葉竹柏枝葉甲醇提取物對其余6種供試細菌均表現出較好的抑制活性，其中葉片甲醇提取物對供試細菌的抑制活性強于枝條，說明長葉竹柏中的抗菌活性物質主要為非揮發性物質。

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（責任編輯 麻小燕）