木薯NAC轉錄因子Rd26基因克隆及表達

丁澤紅 顏彥 付莉莉 黃猛 鐵韋韋 胡偉

摘要：【目的】克隆木薯NAC轉錄因子Rd26基因（MeRd26）并檢測其在干旱脅迫下的表達量，為Rd26基因抗旱調控機制研究打下基礎。【方法】利用反RT-PCR克隆木薯葉片中的MeRd26基因，對其進行序列比對及系統發育進化樹構建，研究其在栽培種Ku50和野生種W14間的變異情況，并用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測PEG-6000干旱脅迫下的MeRd26基因表達量。【結果】從木薯葉片中克隆獲得的MeRd26基因，長度為1288 bp，包含1041 bp的開放閱讀框，編碼346個氨基酸，且含NAC保守結構域。系統發育進化樹分析結果表明，MeRd26蛋白與楊樹（Potri.011G123300.1）和杞柳（SapurV1A.0127s0020.1）的Rd26蛋白親緣關系較近?；蚪Y構變異分析結果顯示，MeRd26基因有33個SNP位點和7個InDel位點，且大部分變異分布在非編碼區及最后一個外顯子的后半區域?；虮磉_檢測結果顯示，在正常大田種植條件下，栽培種Ku50葉片的MeRd26基因表達量是野生種W14的130倍，但在根中表達量差異較??；在干旱脅迫下，栽培種Ku50未展開葉、老葉和根中MeRd26基因表達被快速誘導，表達量隨脅迫時間的延長而增加，在根中表達量最高，但在第1片完全展開葉中，MeRd26基因的表達被抑制，其表達量明顯降低。【結論】MeRd26基因在轉錄水平上參與了木薯抗干旱脅迫反應，可作為候選基因用于木薯抗旱機制研究。

關鍵詞： 木薯；NAC轉錄因子；Rd26基因；克?。槐磉_

中圖分類號： S533 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1822-05

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to clone NAC transcription factor Rd26 gene（MeRd26） from Manihot esculenta Crantz and detect its expression level under drought stress，in order to provide a foundation for further research on regulation mechanism of MeRd26 gene in response to drought. 【Method】MeRd26 gene was cloned from M. esculenta leaf by RT-PCR，and its sequence was aligned with sequences of other species，then their phylogenetic tree was constructed. Subsequently，its structural variation between wild variety W14 and cultivated variety Ku50 was revealed，and its expression level under PEG-6000 drought stress was detected by quantitive real-time PCR（qPCR）. 【Result】MeRd26 gene was cloned successfully from M. esculenta leaf，with length of 1288 bp，containing open reading frame（1041 bp），encoding 346 amino acids，containing NAC conserved domain. Phylogenetic tree showed that，MeRd26 protein had close genetic relationship with Rd26 protein of Populus trichocarpa（Potri.011G123300.1） and Salix purpurea（SapurV1A.0127s0020.1）. Gene structure variation analysis revealed that MeRd26 gene had 33 SNPs and 7 InDels，and most of these variations were located in the non-coding region and second half of last exon. Expression analysis showed that，MeRd26 gene in leaf of cultivated variety Ku50 was expressed 130 times as that in wild variety W14，while difference was small in root. Under drought stress，expression of MeRd26 gene was rapidly increased in folded leaf，bottom leaf and root with increase of drought stress time，especially in root with the highest expression level. On the contrary，expression of MeRd26 gene was inhibited and reduced obviously in the first fully expanded leaf. 【Conclusion】MeRd26 gene is involved in drought-resistant reaction at transcriptional level，so it can be served as a candidate gene to further study its role in drought-resistant mechanism of M. esculenta.

Key words： Manihot esculenta Crantz； NAC transcription factor； Rd26 gene； clone； expression

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）是重要的糧食作物和經濟作物，雖然具有抗旱的生物學特性，但干旱脅迫仍會影響木薯的生長和發育，導致木薯塊根產量減少（Okogbenin et al.，2013）。NAC是一類重要的轉錄因子，在植物干旱等逆境脅迫中發揮重要作用（李偉等，2011；孫利軍等，2012）。因此，克隆木薯NAC相關基因，對研究其在木薯抗旱中的調控機制具有重要意義。【前人研究進展】自1996年Souer等首次從矮牽牛中克隆獲得NAC基因以來，陸續在水稻、擬南芥、馬鈴薯、小麥、油菜等物種中發現NAC成員。經研究證實，大多數NAC轉錄因子含有一個保守的N端DNA結合域、一個C端可變結構域和一個核定位信號（Hu et al.，2006）。NAC是一個龐大的基因家族，如水稻和擬南芥分別含有140和105個NAC成員。Rd26是一個重要的NAC轉錄因子（Fujita et al.，2004）。Tran等（2007）研究報道，擬南芥過量表達Rd26基因（ANAC072），能顯著提高其抗旱能力，其原因是過量表達Rd26基因的擬南芥會對脫落酸極度敏感，脫落酸應答基因均上調表達，而Rd26基因功能喪失的植株對脫落酸不敏感，脫落酸應答基因的表達受到抑制，表明Rd26基因通過調控依賴脫落酸抗逆信號途徑參與抗旱脅迫反應（Fujita et al.，2004）。此外，Rd26基因還與鋅指蛋白ZFHD1直接互作，激活下游基因表達參與抗旱脅迫反應（Tran et al.，2007），且其表達受鹽、衰老、活性氧、病原體防御等誘導影響（Nuruzzaman et al.，2013）?！颈狙芯壳腥朦c】目前已有擬南芥（Tran et al.，2007）、馬鈴薯（Singh et al.，2013）、麻瘋樹（Zhang et al.，2015）等作物Rd26基因參與干旱脅迫的研究報道，但關于木薯Rd26基因的研究極少，僅利用cDNA微陣列技術從3個木薯品種中分離出168個干旱脅迫誘導基因，其中包含Rd26基因（Utsumi et al.，2012），但并未對其進行深入研究?！緮M解決的關鍵問題】克隆木薯NAC轉錄因子Rd26基因（命名為MeRd26），并對其基因結構變異、啟動子順式作用元件，基因表達和系統發育進化樹展開研究，為揭示MeRd26基因抗旱調控機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試木薯栽培種Ku50和野生種W14由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所提供。RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司；SYBR GreenⅠ試劑盒購自TaKaRa公司。主要儀器設備：Mx 3005P熒光定量PCR儀、Biometra PCR擴增儀、DYY-2C穩流穩壓電泳儀及Biorad GelDoc XR凝膠成像系統。

1. 2 干旱脅迫處理

在木薯種植季節，將栽培種Ku50種莖切成長度約15 cm的莖段，挑選帶有芽眼（3～4個/莖段）且粗細均勻的莖段扦插于塑料盆（高18.8 cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm）中，1莖段/盆。栽培基質是由營養土與蛭石按1∶1體積比配制而成。木薯種植10 d后進行間苗，保留1苗/盆。種植60 d后，選取長勢一致的植株用20% PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，以未經PEG-6000干旱脅迫為對照。干旱脅迫處理0、3和24 h后，分別提取葉片（包括未展開葉、第1片完全展開葉和老葉）和根的RNA進行qRT-PCR分析。此外，收集正常大田種植的木薯野生種W14和栽培種Ku50的葉片（種植90 d后）和儲藏根（種植150 d后），用于qRT-PCR分析。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

木薯葉片和根總RNA的提取按照RNA提取試劑盒說明進行操作。利用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 將總RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃保存備用。

1. 4 引物合成及qPCR

根據木薯基因組數據庫提供的序列（Manes.15G084800.1），利用Primer 6.0設計引物，包括MeRd26基因全長引物（L1：5'-TCTACCTCCATTTTCTCTCGT

CC-3'和R1：5'-ACATATGCTCCCCGGAAAAGAA-3'）、actin基因（內參基因）引物（L2：5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'和R2：5'-CCTCCTACGACCCAATCT

CA-3'）（Xu et al.，2013）和MeRd26基因qPCR特異性引物（L3：5'-GCCCGAGATTGATGACCGAT-3'和R3：5'-

TGGAACCGAGTTAAACCCGG-3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照SYBR GreenⅠ試劑盒說明進行pRT-PCR。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行40個循環；95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。每樣品設置3個重復，表達量按照2-ΔΔCt進行計算（胡偉等，2015）。PCR產物送至深圳華大基因科技有限公司進行測序。

1. 5 生物信息學分析

用BLAST搜索Phytozome數據庫，獲取與其他物種同源性較高的序列；用ClustalX進行序列比對和保守結構分析；用MEGA 5.2構建系統發育進化樹；用DnaSP v5.0進行SNP分析及ka/ks計算；用PlantCARE進行啟動子元件分析。

2 結果與分析

2. 1 目的基因的克隆

從采集的葉片中擴增出一個長度為1288 bp的片段（圖1），將其測序結果提交至擬南芥蛋白質數據庫進行BLAST比對，序列相似度達69.9%，表明已成功獲得MeRd26基因。序列分析結果顯示，該片段包含81 bp的5'UTR、1041 bp的開放閱讀框和166 bp的3'UTR；共編碼346個氨基酸，與Phytozome木薯（栽培品種AM506）基因組注釋信息一致。經基因組信息比對，發現MeRd26基因含3個外顯子和2個內含子。

2. 2 系統發育進化樹分析結果

蛋白序列同源性比對結果（圖2）表明，不同物種的Rd26蛋白均含一個高度保守的NAC結構域，推測該結構域是蛋白的功能域。基于Rd26蛋白序列構建的系統發育進化樹分析結果（圖3）表明，MeRd26蛋白與楊樹（Potri.011G123300.1）和杞柳（SapurV1A.0127s0020.1）的Rd26蛋白親緣關系較近，同源性分別為73.22%和73.09%。

2. 3 基因結構變異分析結果

將克隆獲得的MeRd26基因與Phytozome數據庫中的3個木薯材料W14、Ku50和AM506進行序列比對，結果（圖4）發現，MeRd26基因有33個SNP位點和7個InDel位點，且大部分變異分布在非編碼區（5'UTR、內含子和3'UTR）及最后一個外顯子的后半區域；其NAC結構域序列較保守，僅發現2個SNP位點且均屬于同義突變。此外，將木薯栽培種Ku50和野生種W14的MeRd26基因序列分別與栽培種（AM560）進行比對，結果顯示MeRd26基因結構變異主要來自于野生種與栽培種間的差異，栽培種與栽培種間的差異較小，僅有2個SNP位點，且栽培種與野生種ka/ks值為0.305～ 0.385，表明MeRd26基因在木薯進化中受到純化選擇。

2. 4 啟動子元件分析結果

對MeRd26基因起始密碼子上游1500 bp序列進行啟動子元件分析，發現存在大量激素相關的元件，如ABRE（脫落酸順式作用元件）、TCA-element（水楊酸順式作用元件）和GARE-motif（赤霉素順式作用元件）等；此外，還發現大量光相關的元件，如ACE、Box I和G-box等，表明MeRd26基因可能參與調控激素和光相關的代謝。

2. 5 基因表達分析結果

為了驗證MeRd26基因在木薯野生種和栽培種間的變異是否引起其表達水平變化，對正常大田種植的栽培種Ku50和野生種W14的葉片和根MeRd26基因的表達量進行檢測，結果如圖5所示。栽培種Ku50葉片的MeRd26基因表達量是野生種W14的130倍，但在根中表達量差異較小，表明木薯進化過程中，堿基變異主要影響MeRd26基因在葉片中的表達。這可能與該基因的啟動子序列變異有關。

對干旱脅迫下MeRd26基因在不同木薯組織中表達量進行檢測，結果如圖6所示。栽培種Ku50的未展開葉、老葉和根中MeRd26基因表達被快速誘導，表達量隨脅迫時間的延長而增加；在根中表達量最高，與脅迫前相比，脅迫3和24 h后的表達量顯著提高了15倍和21倍（P<0.05，下同）；但在第1片完全展開葉中，MeRd26基因的表達被抑制，與脅迫前相比，脅迫3和24 h后其表達量顯著下降了200%和300%。綜上所述，MeRd26基因在轉錄水平上參與了木薯抗干旱脅迫反應，但在不同組織具有不同的調控功能。

3 討論

由于NAC家族成員的龐大及基因功能的冗余性（李鵬等，2010），其轉基因植株難以獲得預期的表型。因此，須將NAC轉錄因子的結構與功能相聯系進行研究（李偉等，2011）。本研究從木薯中克隆獲得的MeRd26基因，編碼346個氨基酸，含3個外顯子和2個內含子，與大部分NAC基因家族成員一致（李鵬等，2010）。此外，無論是栽培種還是野生種，在MeRd26基因編碼蛋白的N端均有一個高度保守的NAC結構域，但C端具有高度的多態性，C端的變異均遠高于N端。這與李鵬等（2010）報道的在不同物種中N端是高度保守，C端是高度變異區域的結論一致，其原因可能與C端是轉錄調控區，具有轉錄激活或轉錄抑制活性有關（孫利軍等，2012）。本研究還發現MeRd26基因在木薯栽培種Ku50中的表達量明顯高于野生種W14，據此推測木薯野生種和栽培種間C端堿基變異導致MeRd26基因表達水平不同。

Rd26基因表達可被干旱、高鹽、低溫等多種非生物脅迫誘導（Tran et al.，2004；Nuruzzaman et al.，2013），因此，本研究利用PEG-6000溶液對木薯進行干旱脅迫，并檢測MeRd26基因在不同組織中的表達量，結果發現MeRd26基因的表達在不同葉片（未展開葉、第1片完全展開葉和老葉）和根中均存在顯著差異，與在擬南芥中的研究結果一致（Fujii et al.，2011）。此外，Rd26基因的表達可被病原菌侵染等生物脅迫誘導（孫利軍等，2012；Nuruzzaman et al.，2015），但其是否與木薯抗病相關尚需進一步探究。

4 結論

本研究克隆獲得的MeRd26基因在轉錄水平上參與了木薯抗干旱脅迫，可作為候選基因用于木薯抗旱機制研究。

參考文獻：

胡偉，顏彥，韋運謝，王文泉，夏志強，盧誠，侯曉婉，彭明. 2015. 木薯MeASR基因克隆及表達分析[J]. 生物技術通報31（10）：125-130.

Hu W， Yan Y， Wei Y X， Wang W Q， Xia Z Q， Lu C， Hou X W， Peng M. 2015. Clone and expression of MeASR gene in cassava[J]. Biotechnology Bulletin， 31（10）： 125-130.

李鵬， 黃耿青， 李學寶. 2010. 植物NAC轉錄因子[J]. 植物生理學通訊，46（3）： 294-300.

Li P， Huang G Q， Li X B. 2010. Plant NAC transcription factors[J]. Plant Physiology Communications， 46（3）： 294-300.

李偉， 韓蕾， 錢永強， 孫振元. 2011. 植物 NAC轉錄因子的種類、特征及功能[J]. 應用與環境生物學報， 17（4）： 596-606.

Li W， Han L， Qian Y Q， Sun Z Y. 2011. Characteristics and functions of NAC transcription factors in plants[J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology，17（4）： 596-606.

孫利軍，李大勇，張慧娟，宋鳳鳴. 2012. NAC轉錄因子在植物抗病和抗非生物脅迫反應中的作用[J]. 遺傳，34（8）： 993-1002.

Sun L J， Li D Y， Zhang H J， Song F M. 2012. Function of NAC transcription factors in biotic and abiotic stress response in plants[J]. Hereditas， 34（8）： 993-1002.

Fujii H，Verslues P E，Zhu J K. 2011. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 108（4）： 1717-1722.

Fujita M，Fujita Y，Maruyama K，Seki M，Hiratsu K，Ohme-Ta-

kagi M，Tran L S P，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K. 2004. A dehydration-induced NAC protein， RD26， is involved in a novel ABA-dependent stress-signaling pathway[J]. The Plant Journal， 39（6）： 863-876.

Hu H H，Dai M Q，Yao J L，Xiao B Z，Li X H，Zhang Q F，Xiong L Z. 2006. Overexpressing a NAM， ATAF， and CUC（NAC） transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 103（35）： 12987-12992.

Nuruzzaman M， Sharoni A M， Kikuchi S. 2013. Roles of NAC transcription factors in the regulation of biotic and abiotic stress responses in plants[J]. Frontiers in Microbiology， 4： 248.

Okogbenin E， Setter T L， Ferguson M， Mutegi R， Ceballos H， Olasanmi B， Fregene M. 2013. Phenotypic approaches to drought in cassava： review[J]. Frontiers in Physilogy， 4： 93.

Singh A K， Sharma V， Pal A K， Acharya V， Ahuja P S. 2013. Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription factor family in potato（Solanum tuberosum L.）[J]. DNA Research， 20（4）： 403-423.

Souer E， van Houwelingen A， Kloos D， Mol J， Koes R. 1996. The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries[J]. Cell， 85（2）： 159-170.

Tran L S P， Nakashima K， Sakuma Y， Osakabe Y， Qin F， Simpson S D， Maruyama K， Fujita Y， Shinozaki K， Yamaguchi-Shinozaki K. 2007. Co-expression of the stress inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis[J]. The Plant Journal， 49（1）： 46-63.

Tran L S P， Nakashima K， Sakuma Y， Simpson S D， Fujita Y， Maruyama K， Fujita M， Seki M， Shinozaki K， Yamaguchi-Shinozaki K. 2004. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter[J]. The Plant Cell， 16（9）： 2481-2498.

Utsumi Y， Tanaka M， Morosawa T， Kurotani A， Yoshida T， Mochida K， Matsui A， Umemura Y， Ishitani M， Shinozaki K， Sakurai T， Seki M. 2012. Transcriptome analysis using a high-density oligomicroarray under drought stress in various genotypes of cassava： an important tropical crop[J]. DNA Research， 19（4）： 335-345.

Xu J， Duan X G， Yang J， Beeching J R， Zhang P. 2013. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots[J]. Plant Physiology， 161（3）： 1517-1528.

Zhang C， Zhang L， Zhang S， Zhu S， Wu P Z， Chen Y P， Li M R， Jiang H W， Wu G J. 2015. Global analysis of gene expression profiles in physic nut（Jatropha curcas L.） seedlings exposed to drought stress[J]. BMC Plant Biology， 15（1）： 1-14.

（責任編輯 陳 燕）