23株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因分析

劉萍，閆雪苗，張堅(jiān)磊，穆紅

(1天津市第一中心醫(yī)院，天津300192；2天津醫(yī)科大學(xué))

23株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因分析

劉萍1，閆雪苗2，張堅(jiān)磊1，穆紅1

(1天津市第一中心醫(yī)院，天津300192；2天津醫(yī)科大學(xué))

目的 分析耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的耐藥情況及其耐藥基因，為臨床防治CRE感染提供依據(jù)。方法 收集23株CRE，采用全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)行菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)，采用改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶表型，PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)其耐藥相關(guān)基因(包括blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP)及分布。結(jié)果 23株CRE中，肺炎克雷伯菌11株，大腸埃希菌7株，陰溝腸桿菌2株，產(chǎn)酸克雷伯桿菌2株，枸櫞酸桿菌1株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南的耐藥率為95.65%，對(duì)美羅培南的耐藥率為86.95%；23株菌株均對(duì)哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥，耐藥率為100%；對(duì)阿米卡星的耐藥率為65.21%，對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為86.96%，對(duì)氨曲南的耐藥率為91.30%。改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性16株、陰性7株。PCR法檢出blaKPC型基因6株、blaNDM型基因6株、blaOXA型基因9株、blaVIM型基因2株，未檢出blaIMP型基因。結(jié)論 23株CRE對(duì)多種抗生素耐藥率均較高，其主要耐藥基因型為OXA、KPC、NDM、VIM型碳青霉烯酶基因。

碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌；藥物敏感試驗(yàn)；耐藥基因

碳青霉烯類抗菌藥物(如亞胺培南、美羅培南等)是β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)。但近年來由于碳青霉烯類抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致其耐藥菌株廣泛蔓延，尤其耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的出現(xiàn)，使碳青霉烯類抗菌藥物作為抗腸桿菌科細(xì)菌用藥受到?jīng)_擊。CRE的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，已在世界范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注[1，2]。2010年1月～2015年2月，我們分離了23株不重復(fù)的CRE，并檢測(cè)其耐藥相關(guān)基因。現(xiàn)分析結(jié)果，旨在為臨床防治CRE感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集同期天津市第一中心醫(yī)院從臨床送檢標(biāo)本中分離出的23株CRE，不包括同一患者、同一部位、同一時(shí)期分離的重復(fù)菌株。細(xì)菌標(biāo)本來源：痰液、尿液、膽汁、引流液、腹水、咽拭子及靜脈血。試劑及儀器：Premix Taq、DNA Marker(DL-2000)，日本TaKaRa公司；Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，法國(guó)生物梅里埃公司；ABI7500 PCR儀，美國(guó)ABI公司；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 收集所有菌株，參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，采用Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定。同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，觀察其對(duì)哌拉西林、哌拉西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氨曲南的耐藥情況。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2.2 碳青霉烯酶表型檢測(cè) 采用改良Hodge試驗(yàn)。使用無菌生理鹽水將大腸埃希菌ATCC25922菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?∶10稀釋后接種于M-H瓊脂平板，干燥3～10 min，在平板中心貼敷含10 μg厄他培南的紙片，用接種環(huán)挑取3～5個(gè)待測(cè)菌株從紙片邊緣向平板邊緣劃線，長(zhǎng)度20～25 mm，35 ℃溫箱孵育16～20 h。若待測(cè)菌產(chǎn)碳青霉烯酶，其接種線與大腸埃希菌菌ATCC25922抑菌環(huán)交界處會(huì)產(chǎn)生向抑菌圈內(nèi)增強(qiáng)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，即改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性；反之則為陰性。陽(yáng)性質(zhì)控株為Hodge(+)肺炎克雷伯菌，陰性質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.2.3 細(xì)菌耐藥相關(guān)基因檢測(cè) 收集細(xì)菌接種至血瓊脂平板，置于孵箱內(nèi)35 ℃過夜，分離培養(yǎng)獲得單個(gè)菌落。挑取單個(gè)菌落，加入50 μL無菌雙蒸水混勻，100 ℃沸水浴10 min，裂解細(xì)菌釋放DNA，12 000 r/min離心5 min，檢測(cè)上清液OD260/OD280，計(jì)算DNA含量，所得上清液分裝并-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增碳青霉烯酶基因片段，包括blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP基因。擴(kuò)增引物：blaKPC：上游引物5′-TGTCACTGTATCGCCGTC-3′，下游引物5′-CTCAGTGCTCTACAGAAAACC-3′，片段長(zhǎng)度900 bp；blaNDM：上游引物5′-GCAGCTTGTCGGCCATGCGGGC-3′，下游引物5′-GGTCGCGAAGCTGAGCACCGCAT-3′，片段長(zhǎng)度782 bp；blaOXA：上游引物5′-GCGTGGTTAAGGATGAACAC-3′，下游引物5′-CATCAAGTTCAACCCAACCG-3′，片段長(zhǎng)度438 bp；blaVIM基因：上游引物5′-GTTTGGTCGCATATCGCAAC-3′，下游引物5′-AATGCGCAGCACCAGGATAG-3′，片段長(zhǎng)度389 bp；blaIMP：上游引物5′-GAAGGCGTTTATGTTCATAC-3′，下游引物5′-GTACGTTTCAAGAGTGATGC-3′，片段長(zhǎng)度587 bp。反應(yīng)體系為25 μL，引物終濃度分別為blaKPC、blaVIM、blaIMP為0.3 μmol/L，blaNDM為0.4 μmol/L，blaOXA為0.5 μmol/L，模板量為1 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。將擴(kuò)增出的序列送上海立菲生物技術(shù)有限公司北京分公司測(cè)序，結(jié)果經(jīng)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心行基本局部對(duì)比搜索工具(Blast)比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 本研究共收集CRE 23株，其中肺炎克雷伯菌11株、大腸埃希菌7株、陰溝腸桿菌2株、產(chǎn)酸克雷伯桿菌2株、枸櫞酸桿菌1株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南耐藥22株、中介1株，耐藥率為95.65%；對(duì)美羅培南耐藥20株、中介3株，耐藥率為86.95%；23株菌株均對(duì)哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥，耐藥率為100%；對(duì)阿米卡星耐藥15株，耐藥率為65.21%；對(duì)環(huán)丙沙星耐藥20株，耐藥率為86.96%；對(duì)氨曲南耐藥21株，耐藥率為91.30%。

2.2 碳青霉烯酶表型 23株CRE中，改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性16株、陰性7株，陽(yáng)性率為69.56%。

2.3 細(xì)菌耐藥相關(guān)基因 23株CRE均擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶。其中blaOXA型基因9株，陽(yáng)性率為39.13%；blaKPC型基因6株，陽(yáng)性率為26.09%；blaNDM型基因6株，陽(yáng)性率為26.09%；blaVIM型基因2株，陽(yáng)性率為8.70%；未擴(kuò)增出blaIMP型基因。擴(kuò)增出的序列經(jīng)Blast軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對(duì)，證實(shí)為KPC、NDM、OXA、VIM型碳青霉烯酶基因。各菌株耐藥基因型分布見表1。

表1 23株CRE耐藥基因型分布(株)

注：“-”表示該菌株無對(duì)應(yīng)的耐藥基因型。

3 討論

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性尤其是多重耐藥性給抗感染治療帶來巨大困難，已成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題之一。CRE已有許多國(guó)家和地區(qū)報(bào)道，我國(guó)某些地區(qū)也出現(xiàn)過耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯菌暴發(fā)流行。其耐藥機(jī)制主要有產(chǎn)生碳青霉烯酶、主動(dòng)外排系統(tǒng)活躍、產(chǎn)生ESBLs或AmpC酶、外膜蛋白的缺失或數(shù)量減少，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是主要耐藥機(jī)制[3，4]。

本研究從臨床送檢標(biāo)本中分離出23株CRE，其中肺炎克雷伯菌11株、大腸埃希菌7株，與紀(jì)明宇等[5]報(bào)道的耐藥菌株流行情況基本一致。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南的耐藥率為95.65%，對(duì)美羅培南的耐藥率為86.95%；對(duì)頭孢菌素類抗生素頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、半合成青霉素類抗生素哌拉西林全部耐藥；對(duì)阿米卡星的耐藥率為65.21%；對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為86.96%，對(duì)氨曲南的耐藥率為91.30%。表明23株CRE均表現(xiàn)為多重耐藥且耐藥率均較高。

改良Hodge試驗(yàn)是美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法[6，7]。改良Hodge試驗(yàn)基于產(chǎn)酶菌株對(duì)美洛培南或厄他培南的耐藥，是CLSI推薦的檢測(cè)碳青霉烯酶表型的惟一篩查方法。本研究23株CRE，改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性16株。其陽(yáng)性菌株較少的原因可能與某些菌株的碳青霉烯酶產(chǎn)量較低有關(guān)。

目前，在腸桿菌科細(xì)菌中，已發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶主要是A、B、D類酶[8]。A類碳青霉烯酶水解碳青霉烯類、頭孢菌素類、青霉素類和氨曲南等抗菌藥物，包括SME、IMI、NMC、GES和KPC型等，其中KPC型最多[9]。KPC型碳青霉烯酶可水解碳青霉烯酶類抗菌藥物的β-內(nèi)酰胺酶，迄今為止全球已發(fā)現(xiàn)13個(gè)亞型[10]。我國(guó)自2007年起陸續(xù)有腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的報(bào)道，且主要為產(chǎn)KPC-2型[11]。本研究23株CRE菌株中，有7株攜帶blaKPC基因，可見KPC型碳青霉烯酶基因檢出率較高。這7株菌均對(duì)碳青霉烯酶類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗菌藥物耐藥，其耐藥機(jī)制可能與A類碳青霉烯酶的水解機(jī)制有關(guān)。B類酶包括IMP、VIM和NDM等金屬酶[12，13]，其活性位點(diǎn)有Zn2+，能滅活青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯酶類抗生素，對(duì)氨曲南無水解活性。本研究23株CRE中，2株攜帶blaVIM基因，均為陰溝腸桿菌；6株攜帶blaNDM基因，4株為大腸埃希菌、1株為肺炎克雷伯菌、1株為產(chǎn)酸克雷伯菌；均對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，只有1株產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)氨曲南敏感，其他均耐藥。在腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)D類酶中的OXA型酶，且不同細(xì)菌產(chǎn)OXA型酶亦不相同[14]。該類酶的底物譜狹窄，不能水解廣譜頭孢菌素和氨曲南，對(duì)亞胺培南的親合力較高[15]。但水解效能較低，其耐藥性表現(xiàn)有賴于膜通透性降低等其他耐藥機(jī)制的協(xié)同作用[16，17]。本研究檢測(cè)到9株OXA型酶菌株。這些菌株對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類、青霉素類和氨曲南以及氟喹諾酮類等抗菌藥物均呈現(xiàn)耐藥趨勢(shì)。

本院23株CRE的耐藥基因主要為KPC型、NDM型和OXA型碳青霉烯酶基因，為我院CRE院內(nèi)感染的防控提供了依據(jù)。

[1] Arias CA, Murray BE. Antibiotic-resistant bugs in the 21st century-a clinical super-challenge[J]. N Engl J Med, 2009,360(5):439-443.

[2] 汪明,孫自鏞,陳中舉,等.碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,35(4):339-334.

[3] Walther-Rasmussen J, Hoiby N. Class A carbapenemases[J]. J Antimicrob Chemother, 2007,60(3):470-482.

[4] Queenan AM, Bush K. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases[J]. Clin Microbiol Rev, 2007,20(3):440-458.

[5] 紀(jì)明宇,耿大影,裴鳳艷,等.KPC型碳青霉烯酶研究概況及進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2013,31(4):282-285.

[6] Amjad A, Mirza Ia, Abbasi S, et al. Modified Hodge test: A simple and effective test for detection of carbapenemase production[J]. Iran J Microbiol, 2011,3(4):189-193.

[7] 胡麗慶,石玉波,等.寧波地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶基因的檢測(cè)研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2011,23(6):529-532.

[8] Martinez-Martinez L, Pascual A, Hernandez-Alles S, et al. Roles of beta-lactamases and porins in activities of carbapenems and cephalosporins against Klebsiella pneumoniae[J]. Antimicrob Agents Cheemother, 1999,43(7):1669-1673.

[9] 劉瑛,俞靜,費(fèi)奇力,等.產(chǎn)氣腸桿菌對(duì)碳青霉烯酶類抗生素的耐藥機(jī)制研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,33(3):275-279.

[10] Bornet C, Chollet R, Mallea M, et al. Imipenem and expression of multidrug efflux pump in Enterobacter aerogenes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003,301(4):985-990.

[11] Zhang R, Zhou HW, Cai JC, et al. Plasmid-mediated carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in carbapenem-resistant serratia marcescens isolates from Hangzhou, China[J]. J Antimicrob Chemother, 2007,59(3):574-576.

[12] 王麗娟，李武平，等.76例耐亞胺培南銅綠假單胞菌菌B類碳青霉烯酶與耐藥現(xiàn)狀研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)學(xué)雜志,2013,34(5):559-561.

[13] Kruttgen A, Razavi S, Imohl M, et al. Real-time PCR assay and a synthetic positive control for the rapid and sensitive detection of the emerging resistance gene New Delhi Metallo-β-lactamase-1(blaNDM-1)[J]. Med Microbiol Immunol, 2011,200(2):137-141.

[14] Ruiz E, Ocampo-Sosa AA, Alcoba-Florez J, et al. Changes in ciprofloxacin resistance levels in enterobacter aerogenes isolates associated with variable expression of the aac(6′)-Ib-cr gene[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2012,56(2):1097-1100.

[15] 李文青，吳偉元，盧月梅，等.碳青霉烯不敏感鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與碳青霉烯酶耐藥基因檢測(cè)[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，20(5)：549-552.

[16] 錢菁菁，周翠，陳櫟江，等.鮑曼不動(dòng)桿菌OXA型碳青霉烯酶基因型檢測(cè)分析[J].疾病檢測(cè)，2014，29(7)：556-559.

[17] 李智偉，王玲玲，秦文.鮑曼不動(dòng)桿菌OXA碳青霉烯酶基因檢測(cè)分析[J].中華醫(yī)院感染雜志，2013，23(20)：4868-4871.

國(guó)家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目(2013-544)。

穆紅(E-mail： tjmuhong@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.035

R37

B

1002-266X(2016)24-0091-03

2015-08-10)