急性髓系白血病患者骨髓單個核細胞FANCD2表達及意義

鄧娜，婁曄，于一冰，王曉鷗，樊華

(1中國醫科大學附屬第四醫院，沈陽110032；2大慶市油田總醫院；3秦皇島市第一醫院)

急性髓系白血病患者骨髓單個核細胞FANCD2表達及意義

鄧娜1，婁曄2，于一冰3，王曉鷗1，樊華1

(1中國醫科大學附屬第四醫院，沈陽110032；2大慶市油田總醫院；3秦皇島市第一醫院)

目的 探討急性髓系白血病(AML)患者骨髓單個核細胞范可尼貧血互補群蛋白質D2(FANCD2)表達及意義。方法 選擇AML患者111例，其中初診64例、完全緩解27例、復發20例；另選缺鐵性貧血患者28例、血小板減少性紫癜患者14例作為對照組。患者均于入院時抽取骨髓，提取骨髓單個核細胞，采用Western blotting法檢測骨髓單個核細胞FANCD2表達。分析骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量與AML患者性別、年齡、AML分型的關系。結果 初診AML患者骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量為0.477±0.127，完全緩解AML患者為1.284±0.067，復發AML患者為0.410±0.026，對照組為1.352±0.066；初診及復發AML患者骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量均低于對照組(P均<0.05)，其余組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。AML患者骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量與性別、年齡、AML分型均無關(P均>0.05)。結論 AML患者骨髓單個核細胞FANCD2表達降低，FANCD2表達降低或缺失可能參與AML的發病及復發。

急性髓系白血病；范可尼貧血互補群蛋白質D；骨髓單個核細胞

范可尼貧血(FA)是一種常染色體隱性遺傳病，以染色體不穩定且高度易患急性髓系白血病(AML)[1]、頭頸部鱗狀細胞癌、婦科腫瘤等為特征。FA的發病機制為基因表達異常所致FA/BRCA通路失活，導致DNA損傷修復功能缺陷[2～5]。范可尼貧血互補群蛋白質D2(FANCD2)是FA/BRCA通路中的關鍵蛋白，其表達異常與乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤的發病有關，但FANCD2表達變化與AML關系的研究鮮見報道。本研究探討AML患者骨髓單個核細胞FANCD2的表達變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2007年9月～2015年7月中國醫科大學附屬第一醫院和第四醫院收治的AML患者111例(AML組)，男62例、女49例，年齡19～78歲、中位年齡56歲，AML分型：M1型5例、M2型28例、M3型35例、M4型10例、M5型25例、M6型8例；初診64例，完全緩解27例、復發20例。AML緩解和復發均符合骨髓細胞形態學(M)、細胞免疫學(I)、細胞遺傳學(C)和分子生物學(M)標準，即MICM標準。同期另選缺鐵性貧血患者28例、血小板減少性紫癜患者14例作為對照組，男24例、女18例，年齡25～72歲、中位年齡54歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 骨髓單個核細胞FANCD2表達檢測 采用Western blotting法。兩組均于入院時選擇髂前或髂后上棘作為穿刺點，常規方法抽取骨髓3～5 mL，肝素抗凝；緩慢注入4 mL淋巴細胞分離液，2 100 r/min離心20 min；取中間細胞層，PBS洗滌(1 500 r/min離心5 min)，棄上清；加入蒸餾水2 mL作用1 min，再加入1.8% NaCl 2 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；留取1×106個單個核細胞(約50 μL細胞沉淀)，-80 ℃冰箱凍存。將提取的骨髓單個核細胞在RIPA-buffer蛋白裂解液中裂解，超聲破碎細胞，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，采用分光光度計檢測FANCD2表達；取25 μg置于10% SDS-PAGE凝膠上電泳；將電泳產物轉移至PVDF膜上，加入兔抗人FANCD2一抗，4 ℃孵育過夜；加入山羊抗兔二抗，顯影劑顯影。以β-actin為內參。采用GTS圖像分析系統掃描目的條帶，以校正值K對目的條帶灰度值進行半定量分析。K=FANCD2條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。并分析骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量與AML患者性別、年齡、AML分型的關系。

2 結果

初診AML患者骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量為0.477±0.127，完全緩解AML患者為1.284±0.067，復發AML患者為0.410±0.026，對照組為1.352±0.066；初診及復發AML患者骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量均低于對照組(P均<0.05)，其余組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。AML患者骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量與性別、年齡、AML分型均無關(P均>0.05)，見表1。

表1 骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量與AML患者性別、年齡、AML分型的關系

3 討論

FANCD2基因定位于3p25.3，有44個外顯子，編碼兩種均含有1 451個氨基酸的蛋白質(FANCD2-S和FANCD2-L)，兩種蛋白質通過化學修飾可實現相互轉換。FANCD2作為FA/BRCA通路的關鍵基因，是FA/BRCA通路激活的標志。FANCD2的主要功能是參與細胞周期調控、細胞凋亡、DNA損傷修復及維持染色體和基因組穩定。當細胞DNA受到損傷或處于細胞周期S期時，FANCD2在上游FA/BRCA通路核心復合體的作用下發生單泛素化，轉位至細胞核DNA損傷部位，進而招募更多的 DNA 修復蛋白，參與DNA損傷修復過程[6]。基因突變、microRNA序列變異等多種因素均可調控FANCD2的泛素化及表達[7]，當FANCD2低表達或功能缺失時，FA/BRCA通路的正常功能受損，細胞失去保護機制，導致細胞染色體不穩定，最終引起腫瘤的發生。

目前已在多種實體腫瘤中證實，FANCD2蛋白低表達或功能缺失與腫瘤的發生、發展及患者預后相關[8,9]。FANCD2在乳腺癌中的研究較多，10%～20%的乳腺癌細胞中 FANCD2表達缺失[10]；Zhang等[11]發現，乳腺癌組織FANCD2陽性細胞表達率明顯低于正常乳腺組織，且部分侵襲性乳腺癌中FANCD2表達缺失。但也有報道稱，FANCD2基因在卵巢癌早期高表達，Ⅲ期低表達，推測可能臨界腫瘤在惡性轉化過程中激活了相關 DNA 修復和維持基因組穩定的基因，進而導致這些基因表達上調[12]。有研究還發現，FANCD2在正常肺組織中不表達，在非小細胞肺癌組織中可見表達，但表達量與腫瘤分期無關[13]。FANCD2在不同組織中表達不同，可能與組織特異性、樣本量、種族或檢測方法不同有關。

本研究以AML初診、復發及完全緩解患者為研究對象，并選取缺鐵性貧血和血小板減少性紫癜患者作為對照組。因健康成年人的骨髓難以得到，臨床研究獲取其骨髓不符合倫理學要求，缺鐵性貧血和血小板減少患者臨床常規進行骨髓檢查，且二者骨髓各階段造血細胞比例與正常個體大致相同，因此選擇二者作為對照。結果顯示，對照組及AML完全緩解患者骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量均高于AML初診和復發患者，提示FANCD2低表達參與了AML的發生及復發。其機制可能為FANCD2表達降低或缺失可能使下游FANCD2單泛素化缺失，FA/BRCA通路缺陷，導致DNA修復能力下降，細胞的保護機制逐漸喪失，使細胞抵御外來損害的能力下降。本研究還發現，AML患者骨髓單個核細胞FANCD2的相對表達量與性別、年齡及AML分型均無關，可能與本研究病例數較少、研究方法單一有關，確切結果及具體機制有待進一步研究。

總之，AML患者骨髓單個核細胞FANCD2表達降低，FANCD2表達降低或缺失可能與AML的發病及復發有關。

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遼寧省科技廳資助項目(2013225021)。

樊華(E-mail： fanhua66@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.030

R733.71

B

1002-266X(2016)24-0079-03

2016-01-12)