高血壓合并房顫患者外周血SIRT1表達及其與氧化應激的關系

歐陽春，張里克，盧遠航，李先林

(湖北省中山醫院，武漢430030)

高血壓合并房顫患者外周血SIRT1表達及其與氧化應激的關系

歐陽春，張里克，盧遠航，李先林

(湖北省中山醫院，武漢430030)

目的 探討高血壓合并房顫患者外周血沉默信息調節因子1(SIRT1)mRNA和蛋白表達水平及其與氧化應激的關系。方法 選擇高血壓合并房顫患者60例，根據房顫類型分為持續房顫組26例和陣發房顫組34例，另選高血壓竇性心律患者40例(對照組)，分別采用實時熒光定量PCR法和Western blotting法檢測各組外周血單核細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達；采用硫代巴比妥酸法檢測外周血丙二醛(MDA)，免疫比濁法檢測外周血高敏C反應蛋白(hs-CRP)；分析外周血SIRT1表達與MDA、hs-CRP的關系。結果 陣發房顫組SIRT1 mRNA及蛋白表達顯著高于持續房顫組、對照組(P均<0.05)，而持續房顫組、對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。持續房顫組血清MDA、hs-CRP水平均顯著高于陣發房顫組和對照組(P均<0.05)；陣發性房顫組血清MDA、hs-CRP水平較對照組雖有升高趨勢，但兩組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。持續房顫組和陣發房顫組SIRT1表達與MDA呈負相關(P均<0.05)，與hs-CRP無明顯相關性(P均>0.05)，對照組SIRT1表達與MDA、hs-CRP均無明顯相關性(P均>0.05)。結論 SIRT1是心肌細胞的保護因素，與氧化應激呈負相關關系。

高血壓；房顫；氧化應激；沉默信息調節因子1；丙二醛；高敏C反應蛋白

心房顫動(簡稱房顫)是臨床常見的心律失常之一，有研究發現，氧化應激反應所產生的活性氧簇在促進房顫的發生中具有重要作用[1，2]。沉默信息調節因子1(SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰化酶，可通過調節心臟活性氧簇，參與對氧化應激的調控[3，4]。因此推測，外周血SIRT1表達變化可能影響房顫的發生、發展過程，但目前鮮見關于SIRT1與房顫及氧化應激關系的報道。本研究觀察高血壓合并房顫患者外周血SIRT1表達變化，并分析SIRT1與氧化應激的關系，旨在為房顫的預防及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年7月～2014年7月在我院住院治療的高血壓合并房顫患者60例。高血壓的診斷參照《中國高血壓防治指南》(2010年版)[5]；房顫的診斷標準：心電圖顯示P波消失，代之以大小不等、形狀各異、間隔不等、不規則的細小f波，頻率一般為350～600次/min，f波間無等電位線存在，其發作呈持續(持續時間6～12個月)或陣發性(每次發作時間≤48 h，服用藥物后消失或自行消失)。排除標準：①合并冠心病、風濕性心臟病者；②合并嚴重感染或伴有自身免疫性疾病者；③肝腎功能異常或合并呼吸系統疾病者；④罹患糖尿病、繼發性高血壓或惡性腫瘤者。根據房顫類型分為持續房顫組26例、陣發房顫組34例。持續房顫組男11例、女15例，年齡(56.8±6.3)歲，合并高血脂23例；陣發房顫組男14例、女20例，年齡(57.6±7.5)歲，合并高血脂29例。同期另選在我院就診的高血壓竇性心律患者40例(對照組)，男16例、女24例，年齡(55.9±6.1)歲，合并高血脂33例。三組性別、年齡及合并高血脂情況等具有可比性。

1.2 相關指標觀察

1.2.1 外周血SIRT1 mRNA ①總mRNA提取：抽取各組肘靜脈血5 mL，置于抗凝管中，2 500 r/min離心10 min，分離單核細胞；抽取單核細胞，置于離心管中，加入5倍生理鹽水搖勻，2 500 r/min離心15 min，棄去上清液；再加入1.5 mL TRIzol溶液，充分振蕩使細胞完全裂解；分別加入100 μL氯仿、500 μL異丙醇搖勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用吸水紙吸干，室溫干燥5 min。將提取的總RNA加入1 μL溴酚藍，置于瓊脂糖凝膠上樣孔內，常規電泳20 min，以紫外分光光度計檢測總RNA光密度(OD)，OD260/OD280為1.8～2.0為合格。②cDNA合成：采用SYBR Green Assay逆轉錄反應體系。將提取的總mRNA按照以下條件逆轉錄為cDNA：總RNA 2 μL，2×buffer 10 μL，Oligo(DT) 0.5 μL，dNTP 10 mmol，逆轉錄酶22 U/μL，DMSO 44 μL，RNasin 0.25 μL，ddH2O 0.25 μL。上述體系放入PCR擴增儀中反轉錄。反應條件：60 ℃變性5 min，30 ℃變性1 min，60 ℃退火20 min，95 ℃延伸10 min，最后10 ℃延伸5 min。③SIRT1 mRNA表達檢測：采用實時熒光定量PCR法。引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司設計，SIRT1上游引物：5′-ATGTAGAGTCTGATGGTCTAGC-3′，下游引物：5′-CGTTGTGGTGTTAGTTTCTGCG-3′；內參GAPDH上游引物：5′-CACGATCATCATCTCTCAGCTT-3′，下游引物：5′-AAGTCGTTCGGATGGCTGTACA-3′；PCR反應體系20 μL：Taq 10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環后72 ℃延伸5 min。根據擴增曲線與溶解曲線計算Ct值，目的基因相對表達量=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct；ΔΔCt=試驗組ΔCt-對照組ΔCt。

1.2.2 外周血SIRT1蛋白 采用Western blotting法。將外周血用裂解液處理后，按照Bradford蛋白定量試劑盒測定蛋白含量；凝膠蛋白電泳，將電泳凝膠用NC膜轉膜后封閉，再置于封閉液稀釋的Ⅰ抗孵育，化學發光顯影后掃描，White/Ultraviolet Transilluminator凝膠成像分析系統進行分析半定量。以β-actin作為內參照，二者比值為相對表達量。

1.2.3 氧化應激指標 清晨空腹抽取各組肘靜脈血2 mL，靜置1 h，2 500 r/min分離15 min，取血清，保存備檢。采用硫代巴比妥酸法檢測血清丙二醛(MDA)、采用免疫比濁法檢測血清高敏C反應蛋白(hs-CRP)。

2 結果

2.1 各組外周血SIRT1 mRNA及蛋白表達比較 見表1。

表1 各組外周血SIRT1 mRNA及蛋白相對表達比較

注：與持續房顫組比較，*P<0.05；與陣發房顫組比較，#P<0.05。

2.2 各組血清MDA、hs-CRP水平比較 見表2。

表2 各組血清MDA、hs-CRP水平比較

注：與持續房顫組比較，*P<0.05。

2.3 SIRT1 mRNA表達與MDA、hs-CRP的關系 相關性分析顯示，持續房顫組、陣發房顫組SIRT1 mRNA表達與MDA均呈負相關(r分別為-0.589、-0.324，P均<0.05)，與hs-CRP均無明顯相關性(r分別為0.171、0.198，P均>0.05)；對照組SIRT1 mRNA表達與MDA、hs-CRP均無明顯相關性(r分別為0.203、0.257，P均>0.05)。

3 討論

據統計，60歲以上人群房顫的發病率約為1%，其發病率隨著年齡增長逐漸升高[6]。研究證實，高血壓伴發房顫患者發生栓塞性并發癥的風險明顯增加。房顫發生時心房肌的氧化應激產物增加、氧化還原基因表達失衡以及線粒體DNA存在氧化損傷，表明氧化應激與房顫的發生有關；氧化應激反應會損傷線粒體和鈣泵功能，導致細胞內鈣超載，進而激活依賴鈣離子蛋白水解酶，促使心肌收縮功能減退，繼而導致心房結構重構[7]。因此，對高血壓患者給予抗氧化作用藥物，可防止心房結構重構，減少房顫的發生。

SIRT是存在于多種生物中的高度保守基因，在人類共有7個同源基因，目前研究較多的是SIRT1。SIRT1在多種疾病中參與氧化應激反應的調控[8]。樊磊等[9]研究發現，SIRT1與先天性心臟病、心肌炎、心力衰竭等心臟疾病密切相關；SIRT1主要參與調節心肌細胞的生長、分化過程，對心臟的發育具有促進和保護作用[10]。Ulas等[11]在動物研究中發現，激活SIRT1能夠促進內皮細胞NO合酶的活性，改善內皮功能，進而抑制動脈粥樣硬化。趙軍等[12]通過建立心室快速起搏所致心力衰竭犬模型發現，心肌SIRT1表達水平顯著升高，提示SIRT1能夠避免心肌細胞發生凋亡，證實SIRT1能夠抑制心臟組織重構所致的心力衰竭。氧化應激反應參與了房顫的發生，其機制可能是氧化應激導致心房組織發生結構和電生理重構。譚含璇等[13]對心房快速起搏房顫犬給予抗氧化劑后，房顫發生率明顯降低，房顫持續時間明顯縮短，證實活性氧清除劑能夠抑制心房發生電生理重構。胡明珠等[14]報道，SIRT1表達上調能夠激活FOXO信號途徑，導致機體氧化應激水平顯著降低，從而避免機體發生氧化應激損傷。鄔云斌等[15]也證實，SIRT1能夠通過抑制氧化應激水平，阻斷p53誘導的細胞凋亡；當機體發生氧化應激反應時，SIRT1能夠使p53去乙酰化，調節細胞的代謝；而能量限制會進一步誘導SIRT1表達增加，使細胞氧化應激損傷減輕。推測SIRT1可能參與了房顫的發生。

本研究結果顯示，陣發房顫組SIRT1表達水平顯著升高，提示在房顫早期SIRT1高表達能夠抑制房顫的發展，但隨著陣發性房顫發展成持續性房顫，SIRT1表達開始降低。本研究還發現，持續房顫組血清MDA、hs-CRP水平顯著高于對照組、陣發房顫組，而陣發房顫組與對照組比較，血清MDA、hs-CRP水平也有升高趨勢，提示炎癥對房顫的促發和維持可能有一定作用。相關分析顯示，無論持續還是陣發房顫，SIRT1 mRNA表達與MDA均呈負相關，而對照組SIRT1 mRNA表達與MDA、hs-CRP無明顯相關性，與孫雪林[16]等報道一致。當炎癥因子沉積于心房組織中，會導致局部組織發生纖維化，進而誘發房顫；炎癥與氧化應激互為因果，共同導致心房結構和功能發生重構[17，18]。房顫患者SIRT1表達與MDA呈負相關，說明SIRT1能夠抑制氧化應激，特別對于陣發房顫。SIRT1能夠在早期抑制房顫的發展。但隨著房顫程度的加重，這種保護作用開始減弱[19，20]。

綜上所述，高血壓合并房顫患者外周血SIRT1表達增加，SIRT1與氧化應激呈負相關，與hs-CRP無明顯相關性，故認為SIRT1是心肌細胞的保護因素，通過降低氧化應激反應可抑制房顫的進展。但本研究未充分考慮持續SIRT1表達對心肌細胞和房顫的不利影響，確切結論還有待于進一步研究證實。

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