酒精性肝病大鼠肝組織PPARα表達(dá)及意義

曹智麗，周俊英，王娟，王艷，王維，張文雙

(1河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院，河北張家口075100；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院)

酒精性肝病大鼠肝組織PPARα表達(dá)及意義

曹智麗1，周俊英2，王娟1，王艷1，王維1，張文雙1

(1河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院，河北張家口075100；2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院)

目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)在酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 選擇Wistar大鼠50只，隨機(jī)取40只采用乙醇灌胃法制備酒精性肝病模型，根據(jù)造模時(shí)間不同分為模型4、8、12、16周組。至造模結(jié)束，共成模35只，模型4、8、12、16周組分別10、9、8、8只；剩余10只作為正常對(duì)照組，不予任何處理。各組處死后留取肝組織標(biāo)本。采用免疫組化染色法、Western blotting法、RT-qPCR法檢測(cè)PPARα蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果 免疫組化染色顯示，PPARα蛋白定位于肝細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色染色。正常對(duì)照組肝細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)豐富；隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，各模型組肝組織PPARα蛋白表達(dá)逐漸減少，模型16周組肝組織僅見少量PPARα蛋白表達(dá)。Western blotting、qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各模型組PPARα蛋白及mRNA表達(dá)均低于正常對(duì)照組(P均<0.05)；隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，PPARα蛋白及mRNA表達(dá)逐漸降低(P均<0.05)。結(jié)論 PPARα可能參與酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展。

酒精性肝病；過氧化物酶體增殖物激活受體α；大鼠

近年來，酒精性肝病的發(fā)病率逐年升高，已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損傷的第二大病因。酒精性肝病的病理變化最初主要為肝細(xì)胞脂肪變性，隨后進(jìn)展為脂肪性肝炎、肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是核激素受體家族中的配體激活受體，分為α、β、γ三種亞型，其中PPARα可通過多種途徑參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。但其在酒精性肝病發(fā)病過程中作用的研究鮮見報(bào)道。2013年12月～2014年12月，我們觀察了酒精性肝病大鼠肝組織PPARα表達(dá)，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其在酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠50只，清潔級(jí)，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，濕度(70±5)%。主要儀器：UV-2550PCX型紫外分光光度計(jì)，寧波新芝生物科技股份有限公司；ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司；電泳儀，美國(guó)Hoefer公司；5417R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)EP公司。主要試劑：TRIzol試劑，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、PPARα上下游引物、β-actin上下游引物，美國(guó)Invitrogen公司；PPARα抗體，美國(guó)Epitomics公司；β-actin抗體，杭州華安生物有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，美國(guó)KPL公司；ECL發(fā)光液，美國(guó)Santa Cruz公司；RIPA細(xì)胞裂解液，北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜，美國(guó)Millpore公司。

1.2 模型制備及干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)取40只采用乙醇灌胃法[1]建立酒精性肝病模型。根據(jù)造模時(shí)間不同分為模型4、8、12、16周組，每組10只。1～4周給予30%乙醇5.0 g/(kg·d)灌胃，5～8周給予40%乙醇6.0 g/(kg·d)灌胃，9～12周給予50%乙醇7.0 g/(kg·d)灌胃，13～16周給予60%乙醇8.0 g/(kg·d)灌胃。每日9：00灌胃，1次/d。模型制備過程中5只大鼠因乙醇誤吸入氣管窒息死亡，模型4、8、12、16周組分別有10、9、8、8只成模。各組造模結(jié)束禁食12 h處死，留取肝組織標(biāo)本。剩余10只作為正常對(duì)照組，不予任何處理，直接處死留取肝組織標(biāo)本。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 肝組織PPARα蛋白表達(dá) ①采用免疫組化法。取各組肝組織，4%中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)方法制備組織切片，免疫組化染色，顯微鏡下觀察。②采用Western blotting法。取100 mg肝組織制備組織勻漿；提取蛋白并定量后，行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將PPARα、β-actin一抗加入不同標(biāo)記的PVDF膜上，洗膜、定影，最后ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值作為PPARα蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 肝組織PPARα mRNA表達(dá) 采用RT-qPCR法。取部分肝組織以TRIzol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒、ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測(cè)定PPARα mRNA表達(dá)。引物由美國(guó)Invitrogen公司合成，PPARα：上游引物5′-CACGATGCTGTCCTCCTT-3′，下游引物5′-TCCAGTTCGAGGGCATTG-3′；β-actin：上游引物5′-CCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游引物5′-CTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算PPARα mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

免疫組化染色顯示，PPARα蛋白定位于肝細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色染色。正常對(duì)照組肝細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)豐富(插頁(yè)Ⅱ圖5A)；隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，各模型組肝組織PPARα蛋白表達(dá)逐漸減少(插頁(yè)Ⅱ圖5B、5C、5D)，至模型16周組時(shí)肝組織僅見少量PPARα蛋白表達(dá)(插頁(yè)Ⅱ圖5E)。

正常對(duì)照組肝組織PPARα蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于各模型組(P均<0.05)。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，各模型組肝組織PPARα蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸降低(P均<0.05)。各組肝組織PPARα蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1 各組肝組織PPARα蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型4周組比較，#P<0.05；與模型8周組比較，△P<0.05；與模型12周組比較，▲P<0.05。

3 討論

酒精性肝病是由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，隨著病程進(jìn)展，可逐漸發(fā)展為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化等[2]。酒精性肝病早期典型的病理變化是肝細(xì)胞脂肪變性，一旦去除乙醇誘因，脂肪變性往往能夠恢復(fù)正常。若脂肪合成、分解、代謝等出現(xiàn)異常，代謝紊亂會(huì)加重肝細(xì)胞損傷，且肝細(xì)胞損傷與肝臟脂肪沉積的程度密切相關(guān)。在乙醇引起肝細(xì)胞脂肪沉積的基礎(chǔ)上肝細(xì)胞受到氧化應(yīng)激作用，炎癥反應(yīng)加重，可進(jìn)一步加重肝臟的病理?yè)p傷[3，4]。

PPARα是一種參與調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和運(yùn)輸?shù)暮思に厥荏w，其參與脂質(zhì)代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合、脂肪酸透膜吸收、脂蛋白合成與轉(zhuǎn)運(yùn)等，其表達(dá)與肝臟乙醇代謝和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[5]。有研究證實(shí)，乙醇通過抑制PPARα的表達(dá)及破壞PPARα蛋白的功能，干預(yù)脂肪酸的氧化及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，抑制甘油三酯合成，最終引起脂質(zhì)代謝障礙[6]；而脂質(zhì)代謝失衡可導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)聚集過多，超過肝負(fù)荷，即引起肝細(xì)胞脂肪變性，肝組織內(nèi)過量脂質(zhì)浸潤(rùn)可引起線粒體損傷、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝損傷[7]。Lebrun等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著酒精性肝病造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝組織脂肪沉積逐漸增多，至造模結(jié)束時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)已呈彌漫小泡性脂肪變性。Nakajima等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇長(zhǎng)期喂養(yǎng)可降低小鼠肝組織PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)，下調(diào)PPARα的靶基因表達(dá)，如酰基輔酶α氧化酶、中鏈酰基輔酶α脫氫酶、脂肪酸結(jié)合蛋白等；有研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用乙醇誘導(dǎo)PPARα基因敲除的小鼠比野生型小鼠更易發(fā)生肝損傷，說明PPARα表達(dá)可被乙醇抑制，從而導(dǎo)致脂肪酸β氧化減少，促進(jìn)脂肪酸和甘油三酯的合成，進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性的發(fā)生[10～14]。Sahebkar等[15]研究也證實(shí)，隨著乙醇代謝產(chǎn)物乙醛生成量的增多，PPARα表達(dá)逐漸減少，肝細(xì)胞所受傷害和毒性作用相繼出現(xiàn)，如線粒體損傷、炎性損傷等。

本研究各模型組PPARα蛋白及mRNA表達(dá)均低于正常對(duì)照組；隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，各模型組肝組織PPARα蛋白及mRNA表達(dá)逐漸降低。推測(cè)激活PPARα受體可促進(jìn)脂肪酸氧化基因、脂質(zhì)合成基因的表達(dá)，從而改善乙醇引起的脂質(zhì)代謝紊亂，減輕肝細(xì)胞脂肪累積[16～19]。

綜上所述，我們認(rèn)為PPARα可能參與酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展，其具體作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

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張家口市科技計(jì)劃自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(1521060D)。

周俊英(E-mail： doctorzhoujy@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.010

R575.5

A

1002-266X(2016)24-0031-03

2016-01-12)