三七疫霉病拮抗根際土壤細菌的篩選及初步鑒定

楊麗芬，楊建，高玲玲,3，郭建偉,2，洪亮，程加省，孔瓊，田學軍

（1.紅河學院云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室，云南蒙自 661100；2.中國科學院新疆生態與地理研究所干旱區生物地理與生物資源重點實驗室，烏魯木齊 830011；3.河南省農業科學院農副產品加工研究所,鄭州 450002；4.云南省農業科學院糧食作物研究所/國家小麥改良中心云南分中心，昆明 650205）

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三七疫霉病拮抗根際土壤細菌的篩選及初步鑒定

楊麗芬1，楊建1，高玲玲1,3，郭建偉1,2，洪亮1，程加省4，孔瓊1，田學軍1

（1.紅河學院云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室，云南蒙自 661100；2.中國科學院新疆生態與地理研究所干旱區生物地理與生物資源重點實驗室，烏魯木齊 830011；3.河南省農業科學院農副產品加工研究所,鄭州 450002；4.云南省農業科學院糧食作物研究所/國家小麥改良中心云南分中心，昆明 650205）

摘 要：為了篩選對環境友好的生防細菌防治三七疫霉病，通過高溫處理、稀釋涂布法分別從三七健康及患病植株根際土壤分離了21和16株可培養細菌，并以對峙培養法分別篩選到6和7株拮抗菌株，上述13株拮抗菌株經生理生化特征鑒定為芽孢桿菌屬。結果表明，健康植株根際土壤有較豐富的可培養細菌，而患病植株根際土壤可培養細菌中的拮抗菌株較豐富，表明健康植株與患病植株根際土壤的拮抗細菌豐度發生了變化。解淀粉芽孢桿菌B1的抑菌帶寬達8.5mm，具有一定的潛在生防價值。

關鍵詞：惡疫霉; 根際細菌; 拮抗作用

三七[Panax notoginsing (Burk) F.H.Chen]是傘形目五加科人參屬多年生草本植物，別名田七、山漆、人參三七、血山草、六月淋、蝎子草等，喜溫暖陰濕環境；[1-3]原產于云南文山，目前已多年未見野生三七，栽培種主要種植在云南文山（據文山州生物資源開發與三七產業辦估計，2012年文山州三七種植面積約15.47萬畝）、紅河（據紅河州生物產業辦保守估計，2012年紅河州三七種植面積約12.46萬畝）及廣西、廣東、福建、江西等地.三七具有散瘀止血、消腫止痛的功能，主治咯血、吐血、便血、崩漏、外傷出血、跌撲腫痛、胸腹刺痛等，[4]成為我國重要的名貴中藥材.

據王勇等[5]報道，1952年三七疫病發現于浙江，1994年戚佩坤等[6]報道了廣東南雄的三七疫病，均將病原菌鑒定為惡疫霉[Phytophthora cactorum (Leb.et Cohn) Schroter]；云南省在1959年、1987年均發現三七疫病，2007年從云南文山州文山縣、馬關縣不同海拔地區的7個樣地分離的病原菌均為惡疫霉(P.cactorum).該病害為系統性侵染病害，可以危害莖、葉、根和種子，其發病主要相關因子為溫度、濕度、透光率、地形、輪作年限、氮肥等.[7]

1993年Utkhede的研究表明，枯草芽孢桿菌對由惡疫霉引起的蘋果根腐病具有顯著的抑制作用.[8]此外，芽孢桿菌屬、金黃桿菌屬、假單胞菌屬等多株土壤或植物內生菌顯著抑制辣椒疫霉病等病害.[9-15]目前，劉志強等報道三七根系土壤中的芽孢桿菌對三七根腐病具有較好的拮抗效果及穩定性[16].因而，本研究旨在從三七根際土壤分離耐高溫細菌并篩選拮抗菌株，為三七疫霉病的生物防治提供潛在的應用菌株.

1　材料與方法

1.1 材料

供試三七疫病病原菌惡疫霉(P.cactorum) PHC01、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) BAA01由紅河學院云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室提供，分離自文山州三七病莖；供試健康和患病三七各4株根基土（30g-50g），由張成元于2012年8月按照抖土法[17]采自文山州硯山縣.

病原菌活化及三七根際土壤細菌分離、生理生化特征分析所用PDA培養基、LB培養基、硝酸鹽還原實驗培養基、淀粉水解實驗培養基、酪蛋白水解實驗培養基等均參照東秀珠等，[18]頁碼其中對峙培養法篩選拮抗菌株所用PDA培養基中加10g蛋白胨[19]頁碼.

1.2 耐高溫根際土壤細菌的分離

將健康、患病三七根際土壤樣品分別混合成一份，磨碎、混勻、過篩（100目），每份樣品取10g細土樣放入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，轉速120r/min、25℃恒溫震蕩1d，使土樣與水充分混勻，再用80℃水浴30min以殺死微生物菌體和其他雜菌保留芽孢.[20]熱處理后靜置5min，吸取1mL土壤懸液加入盛有9 mL無菌水的大試管中充分混勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同稀釋度的土壤溶液[18].取各梯度土壤懸液30μL涂布于LB平板，每個梯度3個重復，置于32℃恒溫培養箱中培養48 h.依據菌落質地、顏色、邊緣是否整齊、中央是否凸起等挑取不同形態的菌落進行稀釋涂布分離單菌落，保存備用.[18]

1.3 拮抗性菌株的初篩與拮抗測定

在加有蛋白胨的PDA平板接種病原菌，以四點接種法接種獲得菌株，即以平板中心為圓心以30mm為半徑每隔90°角的圓周線上放置相同孔徑的無菌濾紙，每個濾紙片點接一個菌株5μL菌液，以點接5μL無菌水為對照，每個處理3個重復，28℃恒溫培養5-14d，觀測是否抑制病原菌的生長，并測量抑菌帶大小.

1.4 拮抗細菌的形態及部分生理生化測定

參照東秀珠等方法[18]、并以解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)BAA01為參照菌對拮抗菌株進行革蘭氏染色、淀粉水解、接觸酶反應、硝酸鹽還原等基本的形態學與生理生化測定.

2　結果與分析

2.1 三七根際土壤耐高溫細菌的分離

經80℃恒溫處理30min的土樣，從健康植株根際土樣5個梯度的稀釋涂布LB平板共分離、純化21個細菌菌株；從患病植株根際土樣分離、純化16個細菌菌株，共計獲得37株細菌.結果表明，健康植株根際土樣的可培養細菌多樣性更為豐富，這或許是由于健康植株根系分泌的化合物較為豐富、理化性質穩定，根際細菌類群、數量也相對穩定，均易于分離；而患病植株根系經病原真菌入侵分解產生較多植物組織碎片，具備降解三七根系組織碎片功能的根際細菌相對更容易獲得營養形成優勢種群，導致其他類群的細菌較難分離.

2.2 拮抗三七疫霉病菌株的篩選

采用對峙培養法，從健康植株根際土樣細菌篩選出拮抗性菌株6個（H3、H5、H8、H9、H10、H11），占該樣品分離菌株的28.6%；從患病根際土樣細菌篩選出拮抗菌株7個(B1、B3、B4、B5、B6、B7、B8)，占分離菌株的33.3%.總計獲得拮抗菌株13個，占總菌株數的35.1%，另有64.9%的細菌功能尚不明確.各拮抗菌株對病原菌的抑菌帶寬如表1、圖1所示，其中菌株B1拮抗效果最好，抑菌帶寬達8.5mm.

表1　13株三七疫病拮抗菌的抑菌帶寬及生理生化特征Tab.1 Inhibition zone width,physiological and biochemical characteristics and of antagonistic strains against P.cactorum

圖1　根際土壤細菌與病原菌PHC01的對峙培養Fig.1 Confrontation culture between rhizobacteria and pathogen PHC01.

2.3 拮抗性菌株的鑒定

結合《常見細菌鑒定手冊》經形態學及生理生化特征等初步鑒定，B8屬于枯草芽孢桿菌，其余12株屬于解淀粉芽孢桿菌.

3　討論

三七為多年生喜陰涼、潮濕的植物，三年及以上種植園的疫霉病、根腐病、細菌性青枯病、灰霉病等發病較為嚴重，環形凹地的疫霉病發病率高達50%以上[7,21].吳照祥等[17]利用T-RFLP和Biolog兩種免培養技術研究患根腐病三七田的根際土壤真菌，結果表明健康植株和患病植株的根際土壤真菌群落多樣性無顯著差異，但兩者間某些真菌種類的豐度發生了變化，患病植株根際土壤真菌數量減少；林茂茲等（2012）[22]、楊尚東等（2013）[23]的研究表明，連作作物或患病作物的根際土壤細菌數量減少.本研究利用稀釋涂布法和對峙培養法對比研究了健康植株、患病植株根際土壤可培養細菌和疫霉病拮抗細菌的多樣性，結果表明健康植株根際細菌較豐富，但疫霉病拮抗菌株比例低.這或許是感染疫霉病的三七田內健康植株和患病植株根際土壤細菌的多樣性并未發生顯著性改變，只是可培養細菌某些類群的豐度發生了變化，從而導致健康植株根際土壤中群落組成相對均衡的可培養細菌更易于分離，而患病植株根際土壤可培養細菌中的疫霉病拮抗菌株更易分離.

本研究篩選的13株拮抗細菌經生理生化鑒定，12株屬于解淀粉芽孢桿菌、1株屬于枯草芽孢桿菌，這與辣椒等植物疫霉病拮抗內生及土壤細菌常常篩選到解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等芽孢桿菌是相符的[9,13,15].解淀粉芽孢桿菌B1抑菌帶寬達8.5mm，既具有高拮抗性又具有可抗逆境的芽孢，便于開發抗逆性強、耐貯存的生防菌劑，因而均具有較好的應用前景.

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[責任編輯 魯海菊]

Screening and Preliminarily Identification of Rhizosphere Soil bacterial Controlling Phytophthora Cactorum of Panax Notoginsing

YANG Li-fen1,YANG Jian1,GAO Ling-ling1,3,GUO Jian-wei,HONG Liang1,CHENG Jia-sheng4
(1.Key Laboratory of Higher Quality and Efficient Cultivation and Security Control of Crops for Yunnan Province,Honghe University,Mengzi 661100,P.R.China; 2.Key Laboratory of Biogeography and Bioresource in Arid Land,Institute of Ecology and Geography,Chinese Academy of Sciences,Urumqi 830011,China; 3.Institute of Agricultural Products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,P.R.China; 4.Food Crops Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences/National Wheat Improvement Center Yunnan Branch,Kunming 650205,China)

Abstract:To screen eco-friendly bio-control bacteria controlling Phytophthora cactorum of Panax notoginsing,21 and 16 strains rhizobacteria were separated respectively from healthy and infected Panax notoginsing by thermal processing,tissue crashing method,dilution coating method,additionally 6 and 7 strains antagonistic bacteria among them were respectively selected by confrontation culture method,then total of antagonistic bacteria above were identified as Bacillium spp.through physiological and biochemical characteristics.The results suggested that there were richer cultural bacteria in rhizosphere soil of healthy plants,in contrast that there were relatively richer antagonistic bacteria in rhizosphere soil of infected plants.In another word,the richness of antagonistic bacteria changed in rhizosphere soil of healthy and infected plants.Bacillus amyloliquefaciens B1 identified by physiological and biochemical characteristics,which had a certain potential bio-control value because of inhibition zone width up to 8.5 mm.

Key words:Phytophthora cactorum; Rhizobacteria; antagonism

通訊作者：郭建偉（1979-）男，河南蘭考人，博士，講師，研究方向：農作物病害防治及經濟管理。

作者簡介：楊麗芬（1986-），女，云南宣威人，碩士，助教，研究方向：農作物病害防治及經濟管理研究

基金項目：紅河學院碩士點植物保護一級學科建設項目; 紅河學院中青年學術骨干人才計劃項目（2015GG0206）

收稿日期：2015-06-26

DOI:10.13963/j.cnki.hhuxb.2016.02.007

中圖分類號：Q939

文獻標識碼：A

文章編號：1008-9128（2016）02-0024-03