他克莫司對肝移植患者外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達的影響及意義

張曉寧，王建海，鞠明艷，景亞青，李克秋，李光

(天津醫科大學，天津300070)

·臨床研究·

他克莫司對肝移植患者外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達的影響及意義

張曉寧，王建海，鞠明艷，景亞青，李克秋，李光

(天津醫科大學，天津300070)

目的 探討他克莫司(FK506)對肝移植患者外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達的影響及意義。方法 選擇接受原位肝移植患者60例，均采用FK506+甲基強的松龍+嗎替麥考酚酯三聯用藥治療。肝移植術后第1、3周取外周血，檢測血清ALT、AST及外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達。結果 與肝移植術后1周比較，肝移植術后3周患者血清ALT水平明顯降低(P<0.05)，而血清AST水平變化不明顯(P>0.05)；肝移植術后3周外周靜脈血IL-2基因表達明顯降低(P<0.05)，IL-10基因表達明顯升高(P<0.01)。血清ALT水平與IL-2基因表達呈正相關，與IL-10基因表達呈負相關(P均<0.05)；血清AST水平與IL-2、IL-10基因表達均無相關性(P均>0.05)。結論 FK506可能通過影響外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達，從而抑制免疫排斥，誘導免疫耐受。

肝移植；他克莫司；白細胞介素2；白細胞介素10；天冬氨酸轉氨酶；丙氨酸轉氨酶

肝移植是臨床終末期肝病最有效的治療方式。但移植受體對供體肝的免疫排斥反應會造成一定程度的肝損傷[1]，這是影響移植肝存活的主要因素。肝移植后多種細胞因子參與受體的免疫調節過程，如Th1/Th2細胞調節因子[2]。Th1細胞可分泌IL-2，誘導T、B細胞活化增殖，參與免疫應答；Th2細胞可分泌IL-10，通過抑制IL-2的分泌阻斷抗原遞呈作用，進而抑制T細胞的活化[3]。兩種細胞調節因子與移植物的長期存活和移植物的免疫耐受密切相關。因此，臨床上必須通過使用免疫抑制劑來抑制肝移植后的免疫排斥反應。他克莫司(FK506)是從鏈霉菌屬中分離出的發酵產物，近年來被廣泛用于肝移植的免疫治療[4]。目前對FK506的研究主要集中在其代謝過程與CYP3A5基因多態性的關系，對其藥效學的研究相對較少。為此，我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013～2014年在天津市第一中心醫院初次接受肝移植患者60例，男44例、女16例，年齡(53±9)歲，體質量(71.57±15.84)kg；原發病：肝癌19例，乙肝后肝硬化18例，丙肝后肝硬化9例，隱源性肝硬化10例，酒精性肝硬化1例，原發性膽汁性肝硬化3例。納入標準：①年齡18～65歲；②初次接受原位肝移植手術；③接受FK506+甲基強的松龍+嗎替麥考酚酯三聯用藥。排除標準：①年齡<18歲；②肝移植失敗或治療無效去世；③使用其他免疫抑制劑治療。本研究經天津市第一中心醫院倫理委員會及天津醫科大學倫理委員會批準，患者或家屬知情同意。

1.2 治療方法 所有患者肝移植術后采用聯合免疫抑制劑治療：FK506+甲基強的松龍+嗎替麥考酚酯?；颊哂诟我浦残g后第3天開始口服FK506，初始劑量為4 mg/d，間隔12 h服用，每日晨起服用FK506前檢測血藥濃度，目標血藥濃度為7～10 ng/mL，根據血藥濃度調整用藥劑量；甲基強的松龍術后即刻一次性靜脈給藥1 000 mg，術后次日靜脈給藥量自240 mg/d起，每日減少40 mg，直至給藥量為40 mg/d，之后改為口服強的松片20 mg/d；嗎替麥考酚酯術前即刻一次性口服500 mg，術后次日開始口服100 mg/d。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 血清ALT、AST水平 所有研究對象肝移植術后1、3周取外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清保存備檢。采用光電比色法檢測血清ALT、AST。

1.3.2 外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達 采用TRIzol法抽提外周靜脈血總RNA，超微量分光光度計檢測RNA純度和濃度，RNA濃度>200 ng/μL，OD260/OD280為1.8～2.2，說明提取的總RNA質量合格。采用M-MLV逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，測定cDNA的純度和濃度，cDNA濃度>200 ng/μL，OD260/OD280為1.8～2.2，說明逆轉錄合成的cDNA質量合格。IL-2、IL-10基因表達檢測采用Real-time PCR法。引物序列：IL-2：上游引物5′-CTGGAGCATTTACTGCTGGATT-3′，下游引物5′-GCCTTCTTGGGCATGTAAAAC-3′，PCR產物長度110 bp；IL-10：上游引物5′-CCACGCTTTCTAGCTGTTGA-3′，下游引物5′-GCTCCCTGGTTTCTCTTCCT-3′，PCR產物長度114 bp；GAPDH：上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，PCR產物長度87 bp。PCR反應體系為10 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各0.2 μL，SYBR Green熒光染料5 μL，無核酸酶水2.6 μL。PCR反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計算外周靜脈血IL-2、IL-10基因的相對表達量。

2 結果

2.1 肝移植術后血清ALT、AST水平變化 肝移植術后1、3周血清ALT水平分別為(135.92±22.52)、(85.88±12.55)U/L，血清AST水平分別為(38.84±4.34)、(38.77±4.60)U/L。與肝移植術后1周比較，肝移植術后3周血清ALT水平明顯降低(P<0.05)，血清AST水平變化不明顯(P>0.05)。

2.2 肝移植術后外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達變化 肝移植術后1、3周外周靜脈血IL-2基因的相對表達量分別為1.89±1.25、1.28±1.04，IL-10基因的相對表達量分別為2.19±2.16、4.25±3.26。與肝移植術后1周比較，肝移植術后3周IL-2基因的相對表達量明顯降低(P<0.05)，IL-10基因的相對表達量明顯升高(P<0.01)。

2.3 血清ALT、AST與IL-2、IL-10基因表達的關系 相關性分析顯示，血清ALT水平與IL-2基因表達呈正相關(r=0.412，P<0.05)，與IL-10基因表達呈負相關(r=-0.393，P<0.05)；血清AST水平與IL-2、IL-10基因表達無相關性(r分別為0.115、-0.025，P均>0.05)。

3 討論

肝移植后受體對移植肝的免疫排斥是影響移植肝存活的主要因素。FK506是一種鈣調磷酸酶抑制劑，與FK506結合蛋白結合后，可抑制鈣調蛋白依賴的蛋白磷酸酶抑制活化T細胞核因子的活性，進而抑制IL-2的表達，最終發揮免疫抑制作用[5，6]。目前臨床主要通過監測肝移植患者FK506血藥濃度及肝功能(ALT、AST)來調整用藥劑量[7]，并未深入研究肝移植患者外周血免疫因子的變化，不能準確反映患者的免疫狀態。 IL-2可誘導T、B細胞活化增殖，為調控免疫應答的重要因子，具有廣泛的生物學活性；IL-10是一種多功能負性調節因子，通過抑制IL-2的分泌阻斷抗原遞呈作用，進而抑制T細胞的活化[8]。研究表明，免疫排斥反應的發生常伴有外周靜脈血IL-2基因高表達和IL-10基因低表達、甚至不表達，免疫耐受時與之相反[9～12]。二者與移植物的長期存活和移植物的免疫耐受密切相關[13～15]。本研究中，患者肝移植術后3周血清ALT水平較肝移植術后1周時顯著降低，說明機體免疫排斥造成的肝損傷明顯減輕，移植肝肝功能逐漸趨于穩定；肝移植術后1、3周血清AST水平均在正常范圍，說明移植肝未出現明顯肝損傷。因此，本研究以肝移植術后1、3周為觀察點，觀察了外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達。與肝移植術后1周比較，肝移植術后3周外周靜脈血IL-2基因表達明顯降低，而IL-10基因表達顯著升高，說明FK506可抑制患者體內IL-2基因的表達，減輕免疫排斥反應；同時可增強IL-10基因的表達，誘導免疫耐受。相關性分析發現，血清ALT水平與IL-2基因表達呈正相關，與IL-10基因表達呈負相關，說明肝移植患者免疫狀態可影響術后早期的肝功能；而血清AST水平與IL-2、IL-10基因表達均無相關性，說明一定程度的免疫狀態改變并不會加重肝損傷。

綜上所述，FK506可通過影響外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達，抑制免疫排斥反應，誘導免疫耐受。

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國家高技術研究發展技術(2012AA021003)；國家自然科學基金資助項目(21177091)。

李光(E-mail： lig@tmu.edu.cn)

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R392.4

B

1002-266X(2016)24-0040-03

2015-10-13)