甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關肽對骨形成作用的研究進展*

劉　立，王銀河

1.南京中醫藥大學附屬鼓樓醫院(南京　210029)；2.南京鼓樓醫院 骨科(南京　210029)

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甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關肽對骨形成作用的研究進展*

劉立1，王銀河2△

1.南京中醫藥大學附屬鼓樓醫院(南京210029)；2.南京鼓樓醫院 骨科(南京210029)

【關鍵詞】骨質疏松；甲狀旁腺激素；甲狀旁腺激素相關肽；骨形成

甲狀旁腺激素(parathyriod hormone，PTH)和甲狀旁腺激素相關肽(parathyriod hormone-related peptide，PTHrP)是骨代謝過程中重要的調節因子。骨代謝包括骨形成和骨吸收兩個過程。當骨吸收超過骨形成時，會引起骨量丟失，導致骨質疏松。骨質疏松是以骨量減少和骨組織細微結構破壞為特征的疾病[1]，是一種系統性、全身性骨病，臨床表現為骨骼疼痛，骨脆性增加，易發生骨折，因而減少骨折是抗骨質疏松治療的主要目的。臨床有促進骨形成(PTH、PTHrP和鍶制劑等)、抑制骨吸收(雙膦酸鹽、降鈣素和雌激素受體調節劑等)、促進骨礦化(鈣制劑及維生素D等)3類藥物用于治療骨質疏松，其中抑制骨吸收類藥物，只能延緩疾病的發展，并不能治愈骨質疏松，因此促進骨形成且增加骨量的藥物對臨床應用更具有價值。本文就PTH、PTHrP的促進骨形成的作用及機制綜述如下。

1PTH和PTHrP

PTH是84個氨基酸構成的直鏈肽，它由甲狀旁腺主細胞和嗜酸性粒細胞合成并分泌，相對分子質量為9 500。 位于N端的1-34位氨基酸殘基是主要決定其生物活性的分子結構。PTH參與調節血清鈣平衡、腎磷酸鹽重吸收及維生素D 1α-羥基化，對于升高血鈣、降低血磷及維持細胞外液的穩定起重要作用。PTH不僅介導成骨細胞合成代謝，而且還可以刺激成骨細胞分泌白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)等因子，活化破骨細胞，從而溝通成骨-破骨細胞之間聯系。可見，PTH在維持骨穩態的過程中發揮著雙重調節作用，一方面可增加成骨細胞的數量，促進骨生長因子釋放，從而促進骨形成，增加骨量，另一方面也可增強破骨細胞活性，促進骨吸收，使骨鈣釋放入血[2]。因此，PTH常被用于骨質疏松、骨折及骨缺損的治療。

PTHrP最初是在研究成骨細胞惡性腫瘤引起高鈣血癥的過程中發現的一種多肽類物質。現在研究表明，成人和胎兒的許多正常組織(骨骼、皮膚、心血管、甲狀腺和甲狀旁腺)也可表達PTHrP。PTHrP與PTH在分子結構和信號傳導方面有相同或相似之處，故稱PTH相關肽[3]。PTHrP基因長約15 kb，位于12號染色體短臂，有9個外顯子，通過選擇性剪切和翻譯后修飾主要產生4個功能性片段：N-末端PTHrP(1-36)，其主要發揮PTH樣作用，在骨骼和腎臟中調節鈣磷的體內平衡；中段區域序列PTHrP(37-86)，主要調控胎盤鈣離子的轉運,維持母體胎兒外周血循環中正常的鈣離子濃度梯度；核定位序列(NLS)PTHrP(87-107)，能轉位進入細胞核，發揮胞內分泌功能，刺激細胞的增殖和抑制細胞的凋亡；C-末端PTHrP(108-139)有抑制骨吸收的作用[4]。動物實驗和小范圍臨床試驗均證實，PTHrP可有效促進骨形成，具有潛在的臨床應用前景。

2PTH/PTHrP促進骨形成研究進展

2.1PTH促進骨形成研究

PTH對骨代謝具有雙向調節作用，因此一直倍受研究者們關注。PTH對骨骼合成代謝的作用取決于劑量及給藥方式。Fiaschi-Taesch等[5]研究認為，PTH小劑量時促進骨形成，大劑量時一方面引起破骨細胞廣泛活化，骨質吸收增加，另一方面成骨細胞內特異性轉錄因子、骨鈣素、骨唾液蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達下調，說明成骨細胞的功能受到抑制。PTH的生物效應取決于其作用模式，間歇性使用能夠促進骨形成，而持續使用則會導致骨丟失。Cupp等[6]通過觀察持續性和間歇性給予PTH的異同，發現連續性給藥可導致骨吸收速度增加，間歇性給藥可增加骨小梁，改善骨小梁與骨皮質微結構參數。因此，運用PTH治療骨質疏松需間歇性小劑量給藥。

PTH不同于以往的骨吸收抑制劑，是基于骨重建和骨塑建的骨形成，增加骨量，改善骨結構。Matsumoto等[7]通過對卵巢切除小鼠皮下注射hPTH(1-34)(30 μg·kg-1·d-1，持續18 d)，結果發現hPTH能逆轉雌激素缺乏引起的骨丟失，且可以增加骨小梁和骨皮質的厚度及骨的機械強度。劉海蔚等[8]研究發現，PTH(1-34)能增加絕經后骨質疏松癥婦女腰椎面積骨密度，升高骨轉換指標。

另有研究發現，PTH的促進骨形成作用主要體現在骨小梁，骨皮質骨密度增加不明顯，但骨皮質重建加速導致的骨密度下降并不意味著骨強度下降，骨結構的改善更利于防止骨折的發生。也有報道表明，運用PTH(1-34)治療骨質疏松12～24個月后作用下降，原因有待研究。

2.2PTHrP促進骨形成研究

不同PTHrP片段發揮不同的作用。PTHrP(1-36)和PTH(1-34)都是通過共同的受體來發揮作用，經過相同的信號傳導途徑起作用，但兩者在影響骨代謝方面作用卻不同。PTH對骨代謝有雙向調節作用，而PTHrP(1-36)只選擇性地刺激骨形成，而不促進骨吸收，甚至還有降低骨吸收的作用。對比實驗顯示，PTHrP(1-36)用量為PTH的10倍時,也未發現促進破骨細胞活性的作用。Hildreth等[9]研究發現，PTHrP(1-34)能促進成骨祖細胞增生,但是對骨鈣素、Ⅰ型膠原蛋白及骨唾液蛋白的表達卻沒有影響，提示PTHrP能促進骨形成，但并不直接促進成骨祖細胞分化。Horwitz等[10]對絕經后婦女進行了皮下注射合成的人PTHrP(1-36)實驗,結果表明合成的人PTHrP(1-36)在促進骨形成方面的作用較PTH更好。

王子露等[11]利用重組鼠PTHrP(1-84)片段處理骨髓間充質干細胞發現，重組鼠PTHrP(1-84)片段可促進堿性磷酸酶、膠原的表達和鈣化結節的形成，促進總的成纖維細胞克隆形成單位(CFU-f)的形成，這表明重組鼠PTHrP(1-84)具有促進骨髓間充質干細胞增殖并向成骨細胞分化的作用，為將來使用基因重組人PTHrP(1-84)治療骨質疏松提供了實驗依據和理論基礎。重組人PTHrP不僅能夠防治骨質疏松癥，還能夠降低骨折風險。Mansjur等[12]用重組人PTHrP(1-34)治療骨折后骨質疏松大鼠，給藥12周后測定骨密度、骨鈣素、骨形態計量學和骨生物力學等指標，結果表明其具有促進新骨生成的作用，并且骨轉換增加，骨的韌性增強，從而提高了骨的抗變形能力。

PTHrP核定位序列和C-末端對骨形成也有著重要的作用。Toribio等[13]對基因敲除小鼠進行實驗研究，證明在N-末端存在的情況下PTHrP NLS和C-末端缺失的PTHrP KI小鼠出現明顯骨發育不良，其長骨表現為骨質疏松的表型。因此，在C-末端存在的情況下PTHrP NLS可能是抗骨質疏松和促進骨折愈合的新靶點。但PTHrP NLS是否是通過刺激成骨細胞的增殖和抑制其凋亡來達到抗骨質疏松，以及促進骨折愈合，這一機制尚待研究。但也有學者認為PTHrP羧基末端能夠抑制人成骨樣細胞增殖和分化。

Zhu等[14]研究指出，成骨細胞特異性PTHrP敲除小鼠由于骨形成障礙而表現為骨質疏松，表明了內源性PTHrP的促進骨形成作用。筆者的實驗將PTHrP(1-86)皮下注射于骨質疏松的小鼠模型，結果顯示，PTHrP不僅可以活化1,25二羥VitD，促進骨形成，而且挽救了早期死亡的PTH和1α(OH)ase雙敲骨質疏松模型小鼠，且沒有PTH的副作用[15]。

本課題組基于先前的研究發現，內源性和外源性PTHrP、PTHrP NLS都具有促進骨形成的作用，因此筆者認為，無論是外源性還是內源性PTHrP、PTHrP NLS都具有促進骨折愈合的作用。筆者利用8周齡野生型(WT)小鼠和PTHrP雜合子(PTHrP+/-)小鼠制作了股骨干中段骨折模型，在骨折后4周內分別每天皮下注射外源性PTHrP(1-86)80 μg/kg和相應劑量的生理鹽水作為對照，最后通過組織學、X線、骨密度測定、RT-PCR和Western blot等方法觀察骨痂組織的特征，發現非給藥組的WT小鼠骨折愈合情況明顯優于PTHrP+/-小鼠，表明內源性的PTHrP可以通過促進成骨細胞增殖與活化促進骨折的愈合。而給藥組的PTHrP+/-小鼠的骨折愈合水平接近自然愈合的WT小鼠， 表明外源性PTHrP可以糾正內源性缺失的PTHrP雜合子小鼠的骨折修復能力。另外，筆者運用重組的PTHrP(1-86)和PTHrP(87-139)處理WT小鼠成骨細胞，與對照組相比，處理組堿性磷酸酶(ALP)的表達明顯增高。筆者另一研究也證實，PTHrP可以通過調節核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和護骨素(OPG)的表達，促進糖尿病性骨量減少小鼠的骨合成代謝，抑制骨吸收[15-16]。因此，筆者認為PTHrP(1-86)以及PTHrP (NLS)均能通過促進成骨細胞的增殖和活化發揮抗骨質疏松及促進骨折愈合的作用，但兩者之間可能會存在不同效果。

3PTH/PTHrP對骨形成的作用機制研究

PTH主要通過與PTH/PTHrP受體1相結合促進成骨祖細胞增生分化、抑制成骨細胞凋亡、促進襯里細胞向成骨細胞轉化及刺激成骨細胞產生、促進胰島素樣生長因子Ⅰ和轉化生長因子發揮相應的骨合成效應。成骨細胞受PTH刺激后釋放多種介質，其中胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)不僅可以通過自分泌影響成骨細胞功能，還能顯著抑制PTH刺激的破骨細胞形成數量；轉化生長因子β(TGF-β)，有明顯促成骨作用；白細胞介素6(1L-6)促進骨吸收，在活體動物還可以抑制骨形成；前列腺素(PG)類作用尚不明確。PTH可能能夠直接作用破骨細胞，影響破骨細胞分泌眾多細胞因子，具有促成骨和破骨的雙重效應。PTH受體是經典的B型G蛋白偶聯受體，該受體DNA編碼有585個氨基酸，含有7個跨膜單位，與降鈣素受體具有高度同源性，與其他G蛋白相關受體卻缺乏同源性。常見兩種亞型:PTH受體1(主要位于腎臟和骨組織中)和PTH受體2(主要位于腦組織和胰腺中)。PTH與PTH受體1結合后，通過兩條信號傳導途徑發揮生物作用：一條路徑是通過活化環腺苷酸(cAMP)依賴性的蛋白激酶A(PKA)，即通過與其偶聯的Gs蛋白激活腺苷酸環化酶(AC)，催化ATP-Mg2+生成第二信使cAMP，進一步激活PKA；另一條路徑則是活化鈣離子依賴的蛋白激酶C，即通過Gq蛋白激活磷脂酶C(PKC)，增加DG和IP3。PTH受體2主要以提高細胞內cAMP含量來實現其生物學活性。

PTHrP和PTH通過作用于同一受體，即PTH/PTHrP受體1發揮作用，并通過調節成骨細胞功能影響骨骼代謝，這種作用主要通過cAMP依賴性的PKA和Ca2+依賴性的PKC信號傳導通路誘導成骨細胞增殖和分化。該受體與PTHrP形成配位體而被激活，引起細胞內級聯反應，最初信號可以通過激活G蛋白α-亞單位增加cAMP的合成和激活PKA；也可經α-G蛋白q家族激活PKC以及增加細胞內游離Ca2+水平，這與PTH的兩條信號傳導途徑相同。激活G蛋白偶聯受體，PTHrP可通過平行或者多重并聯的信號傳導途徑發揮誘導成骨細胞增殖和分化的作用。此外，細胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)也是其傳導途徑之一。有研究[17]顯示，抑制MAPK途徑可導致成骨細胞分化標記蛋白減少，這表明其參與PTHrP調節成骨細胞增殖和分化過程。

細胞周期蛋白D1是cAMP、PKC和MAPK信號傳導途徑的下游效應子，調節著這3種信號的傳導。Calvo等[17]研究發現，PTHrP 可以通過ERK1/2、 p38 MAPK以及PI3K信號通路，抑制細胞周期蛋白D1的表達。

成骨細胞分化早期有Ca2+信號出現，力敏感型和電壓敏感型通道都可在成骨細胞表達[18]。通過激活不同的細胞膜Ca2+通道來調節Ca2+內流是成骨細胞一個重要的信號傳導通路。Santa Maria等[19]發現，PTHrP可以對成骨樣細胞的胞內Ca2+進行調節，并誘導該細胞快速Ca2+內流。這些研究表明，PTHrP可與PTHrP受體1以外的成骨細胞受體結合，影響成骨細胞的功能，但機制并不明確。

然而，目前對PTH/PTHrP促進骨形成機制的研究并不多,需要更系統、更深入的探索，為PTH/PTHrP治療骨質疏松、促進骨折愈合提供可靠的理論基礎。

4臨床應用與展望

PTH和PTHrP是治療骨質疏松的促合成劑的代表藥物。2002年，美國政府食品與藥品管理局批準PTH(1-34)(特立帕肽)作為骨形成促進劑用于治療骨質疏松。PTH和PTHrP治療絕經后骨質疏松的療效已得到認可，且不良反應較少，用藥相對安全。PTH在骨質疏松治療方面具有其他治療藥物難以比擬的優勢，但同時也面臨許多尚待解決的問題： 1)PTH和PTHrP促進骨形成作用的分子及細胞機制尚不明確； 2)最佳治療時間及藥物使用療程不確定，用藥18～24個月后能否繼續使用不明確； 3)臨床應用時長期皮下注射治療依從性較差，因此可推廣新型透皮貼劑和研制口服制劑以簡化給藥途徑，方便治療； 4)PTH與抑制骨吸收藥物等其他治療骨質疏松藥物的聯合使用方案仍需進一步探索；5)PTH具有促進成骨和促進破骨細胞活性的雙向性作用。有研究[20]表明，PTH在增加骨小梁形成的同時，也可引起骨皮質骨量的下降；6)PTH(1-34)在小鼠的動物實驗中發現,高劑量的PTH可誘發骨肉瘤的形成，雖然臨床尚未見報道，但也存在潛在風險；7)PTH/PTHrP受體分布廣泛，在除骨和腎以外的其他組織也有分布，因此治療骨質疏松時可能會產生一些其他的效應。這些問題尚待進一步研究。

PTHrP的研究越來越多，其較PTH在促進骨形成方面更有優勢，因此，PTHrP成為了防治骨質疏松的候選藥物。基于先前的研究，筆者認為，PTHrP(1-86)和PTHrP NLS在對抗骨質疏松、促進骨折愈合方面有著切實的臨床價值[21]。有學者通過多肽合成儀直接合成PTHrP多肽片斷，但這種方法價格昂貴，且不適用于較長片斷的合成。因此，運用基因工程的方法，以人基因組DNA為模板，通過PCR擴增PTHrP基因得到大量的PTHrP(1-86)，這一方法具有高產量、低成本，且不受片段長度限制的優勢。PTHrP作為基因工程藥物經濟效益顯著，且療效優于PTH,具有廣闊的應用前景。

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doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.026

*基金項目：國家自然科學基金資助項目 (No：81271997)；江蘇省醫學重點人才資助項目(No：RC2011150)；南京市衛生局重點課題資助項目(No：ZKX 10007)

通信作者：△王銀河，E-mail：649218775@qq.com

【中圖分類號】R336

【文獻標志碼】A

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160406.1558.034.html

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