白細胞介素-4對原代星形膠質細胞炎癥因子的影響*

楊　茜，單明慧，楊　明，蘇炳銀，李淑蓉△

1.成都醫學院 病理學與病理生理學教研室(成都　610500);2.發育與再生四川省重點實驗室 (成都　610500)

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白細胞介素-4對原代星形膠質細胞炎癥因子的影響*

楊茜1，單明慧2，楊明1，蘇炳銀2，李淑蓉1△

1.成都醫學院 病理學與病理生理學教研室(成都610500);2.發育與再生四川省重點實驗室 (成都610500)

【摘要】目的探討白細胞介素-4(IL-4)對星形膠質細胞炎癥因子釋放的影響。方法選取新生1～2 d的C57乳鼠，取大腦皮層制備原代星形膠質細胞，傳代3次，檢測星形膠質細胞純度，IL-4刺激后，用Q-PCR來檢測多種炎癥因子的釋放。結果原代培養的星形膠質細胞純度高達95%，用IL-4刺激后，抗炎因子ARG1、CD206、TGFβ、IFNβ、IL-10表達升高，促炎因子TNFα、IL-6表達降低。結論IL-4對星形膠質細胞抗炎因子的分泌有促進作用，對促炎因子的分泌有抑制作用。

【關鍵詞】星形膠質細胞；IL-4；炎癥因子

星形膠質細胞是中樞神經系統中分布最廣泛的細胞，在分泌營養物質、調節神經元微環境等各方面均發揮著重要功能[1-2]，參與了多種神經系統疾病的病理過程。星形膠質細胞在調節免疫功能中通過產生炎癥細胞因子來發揮重要作用[3]。白細胞介素-4(IL-4)的作用有刺激活化B細胞和T細胞增殖、CD4+T細胞分化成II型輔助T細胞，同時，在調節適應性免疫和體液免疫中起關鍵作用。IL-4能刺激小膠質細胞向M2表型分化，產生炎癥抑制因子，也能抑制單核細胞IL-1、TNF和IL-6的產生。因此，探討IL-4對星形膠質細胞是否具有類似對巨噬細胞的效應，對了解星形膠質細胞的炎癥反應提供幫助。

1材料與方法

1.1主要試劑與設備

DMEM/F12培養基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、胰酶(Gibco)、雙抗(Gibco)、IL-4(R&D)、多聚甲醛(Sigma)、BSA(Sigma)、DEPC(Sigma)、GFAP抗體(中杉金橋)、羊抗兔IgG/HRP(中杉金橋)、real-time PCR試劑盒(羅氏)、二氧化碳培養箱(BioRad)、PCR儀(BioRad)、CFX96 real-time system (BioRad)、倒置顯微鏡(Olympus)。

1.2星形膠質細胞的原代培養

取出生后1～2 d的C57乳鼠，置于75%乙醇中浸泡3 min，在超凈臺內斷頭，剪開頭骨，取出雙側大腦皮質，置于盛有預冷的D-Hank′S液培養皿內，剝離腦膜和血管組織，然后將大腦皮質移至另一培養皿內，并用D-Hank′S液沖洗2次。在培養皿內，將其剪成碎組織塊，移入離心管中，加入適量DMEM/F12培養液，反復吹打，產生均一的細胞懸液。將該細胞懸液注入培養瓶中，使細胞懸液均勻布滿培養瓶底部，繼而每瓶中加入約5 mL完全培養基(DMEM/F12，10%FBS，雙抗)，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，差速黏附處理30 min，此步用來去除成纖維細胞成分。然后，翻轉培養瓶，吸取細胞懸液接種至另一培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每隔3 d換液1次，培養9～10 d，并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞長滿并單層鋪滿瓶底后，進行消化傳代。

1.3星形膠質細胞的鑒定

將傳代的細胞接種于24孔板內，孔內預先放涂有多聚賴氨酸的蓋玻片，37 ℃、5%CO2培養箱中，孵育24 h后，進行GFAP免疫組化顯色，用CD11b標記小膠質細胞，觀察星形膠質細胞純度。

1.4IL-4處理星形膠質細胞并用RT-PCR測定炎癥因子的mRNA水平

不經過任何處理的原代培養的星形膠質細胞為對照組，用IL-4(20 ng/mL) 處理24 h的星形膠質細胞為實驗組，TRIZOL 法抽提細胞總RNA，逆轉錄合成 cDNA。根據羅氏試劑盒說明書進行Q-PCR， 分別觀察抑炎因子ARG1、CD206、TGFβ、IFNβ、IL-10以及促炎因子TNFα、IL-6的表達。

1.5統計學方法

2結果

2.1原代培養的星形膠質細胞的鑒定

星形膠質細胞每次傳代時，取少量細胞種植于用多聚賴氨酸包被的玻片上，24 h后于鏡下觀察細胞貼壁，多聚甲醛固定，進行兔抗GFAP多克隆抗體的免疫細胞化學顯色鑒定所培養的細胞，為排除小膠質細胞的干擾，也用CD11b進行鑒定。可觀察到，培養的細胞幾乎均為星形膠質細胞(圖1)，小膠質細胞非常少(圖2)。傳代3次后，星形膠質細胞純度計數高達95%。

2.2IL-4處理后對星形膠質細胞炎癥因子mRNA水平的影響

用IL-4(20 ng/mL) 處理原代培養的星形膠質細胞24 h后，可觀察到，星形膠質細胞分泌的炎癥抑制因子ARG1、CD206的表達均升高；而分泌的炎癥促進因子TNFα、IL-6則降低，且差異有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖1原代星形膠質細胞GFAP表達(×20)

圖2原代星形膠質細胞細胞CD11b表達(×10)

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3討論

中樞神經系統各種損傷都能刺激星型膠質細胞活化、增殖，如病理損傷、化學性刺激和疾病等，星形膠質細胞可產生多種營養因子，有著保護作用，但同時過度活化的星形膠質細胞也可釋放大量的炎癥因子和神經毒素，誘導神經元變性[4]，甚至形成膠質瘢痕，阻礙神經元修復再生的進行。星形膠質細胞也參與了中樞神經系統的免疫反應。當受到與免疫黏附分子有關的細胞接觸和黏附，或受到某些細胞因子和抗原抗體復合物刺激后，能分泌眾多活性成分，如 IL-6、IL-1、IL-3、TNF-α、NO、LT、白細胞三烯 B4、白細胞三烯 C4 等多種單核細胞趨化及活化因子[5]。小膠質細胞是中樞神經系統中最重要的免疫細胞，在IL-4的刺激下，小膠質細胞能向M2表型轉化，分泌ARG1、IL-10、CD206、IFNβ、TGFβ等炎癥抑制因子，以拮抗M1型的小膠質細胞。在星形膠質細胞中，是否也具有類似的表現？本實驗所測的ARG1、IL-10、CD206、IFNβ、TGFβ等炎癥抑制因子是典型的M2型小膠質細胞所分泌的抗炎因子，TNFα是小膠質細胞炎癥反應釋放的主要的炎性細胞因子，在中樞神經系統病變中起重要作用。TNFα可促進星型細胞和內皮細胞產生趨化因子和黏附分子，并且促進其他炎癥細胞因子(IL-1β、IL-6) 的產生，導致炎癥的惡性循環[6]。IL-6具有協同加強TNFα的作用[7]。IL-4能抑制單核細胞IL-1、TNF和IL-6的產生，而在星形膠質細胞中，IL-4刺激后，同樣能抑制TNFα和IL-6的產生。星形膠質細胞和單核巨噬細胞的來源大相徑庭，卻在炎癥反應方面，與巨噬細胞來源的小膠質細胞有著一定的相似度，具體機制尚有待探討。但不可否認的是，IL-4能刺激星形膠質細胞分泌更多的炎癥抑制因子以及能抑制星形膠質細胞分泌促炎因子，在一定程度上促使星形膠質細胞發揮著對中樞神經系統的保護作用。

參考文獻

[1] Azevedo FA, Carvalho LR, Grinberg LT,etal. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain[J]. The Journal of Comparative Neurology, 2009, 513(5):532-541.

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[4] Barnett SC，Linington C．Myelination: do astrocytes play a role?[J]. Neuroscientist，2013,19(5):442-450．

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The Effect of Interleukin-4 on the Release of Inflammatory Factors in Primary Astrocytes

YangXi1,ShanMinghui2,YangMing1,SuBingyin2,LiShurong1△.

1.DepartmentofPathologyandPathophysiology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SichuanKeyLaboratoryofDevelopmentandRegeneration,Chengdu610500,China

【Key words】Astrocytes; Interleukin-4; Inflammatory factors

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Interleukin-4 on the release of inflammatory factors in primary astrocytes. MethodsPrimary cultures of astrocytes were isolated from the suckling mouse which was born just for one or two days, and the astrocyte purity was detected after the third passages culture. Interleukin-4 was used to stimulate the astrocytes, and then Q-PCR was employed to detect the release of various inflammatory factors. ResultsThe purity of the primary astrocytes was up to 95%. The expressions of anti-inflammatory factors such as ARG1, CD206, TGF β, IFN β and IL-10 increased, while the expressions of pro-inflammatory cytokines such as TNFα and IL-6 decreased. ConclusionInterleukin-4 plays an active role in promoting anti-inflammatory cytokines and inhibiting pro-inflammatory cytokines in primary astrocytes.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.004

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(No:31371215；31540032)

通信作者：△李淑蓉，E-mail：lsrsus@163.com

【中圖分類號】R364

【文獻標志碼】A

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1057.022.html

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