失血性休克不同時相sorcin轉位及其與血管反應性變化的相關性分析*

周　榮　丁小麗　劉良明

liangmingliu@yahoo.com

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失血性休克不同時相sorcin轉位及其與血管反應性變化的相關性分析*

周榮丁小麗劉良明#

liangmingliu@yahoo.com

【摘要】目的：觀察失血性休克后不同時相大鼠腸系膜動脈平滑肌sorcin蛋白表達及其對去甲腎上腺素(NE)的反應性，初步探討sorcin是否參與失血性休克血管反應性的調節。方法：36只SD大鼠，12只用作非手術對照組，其余采用經股動脈放血法制成失血性休克(動脈壓40 mmHg)模型。分別將成模大鼠再分為休克早期(30min)組及晚期(2h)組；各組開腹分離腸系膜動脈，采用離體器官張力測定技術檢測腸系膜動脈對NE的反應性；采用Western Blotting(WB)檢測腸系膜動脈平滑肌sorcin的表達及其分布；采用免疫共沉淀聯合WB檢測sorcin-肌漿網2型雷諾定受體(RyR2)表達，并分析休克大鼠sorcin水平與腸系膜動脈對NE反應的相關性。結果：失血性休克早期組大鼠腸系膜動脈對NE的收縮反應較對照組明顯增強(P<0.05)，而晚期組對NE較對照組明顯降低(P<0.05)。早期組和晚期組大鼠腸系膜動脈血管平滑肌sorcin總蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，但發生了明顯轉位現象，即早期組sorcin在胞漿及質膜內表達無明顯差異(P>0.05)，但晚期組sorcin在胞漿內的表達明顯增強，而在質膜的表達顯著降低(均P<0.05)；免疫共沉淀發現，早期組大鼠腸系膜動脈平滑肌sorcin-RyR2復合子表達與對照組無顯著性差異(P>0.05)，而晚期組較對照組明顯減少(P<0.05)；相關性分析顯示，晚期組sorcin由質膜向胞漿移位與其血管反應性呈顯著負相關(P<0.01)。結論：失血性休克后2 h，大鼠腸系膜動脈平滑肌sorcin從RyR2解離，導致sorcin從肌漿網向胞漿轉位，至少部分參與腸系膜動脈對NE低反應性的形成。

【關鍵詞】失血性休克；血管反應性；sorcin蛋白；肌漿網2型雷諾定受體；大鼠

嚴重創傷失血常引起外周血管對血管活性物質如去甲腎上腺素(NE)、精氨酸加壓素等的反應性異常[1]。我們的前期工作證實，血管平滑肌肌漿網2型雷諾定受體(Type Ⅱ Ryanodine Receptor, RyR2)的過度激活與失血性休克晚期血管低反應性形成有關[2，3]，但其通過何種機制導致RyR2的過度激活目前尚未闡明。

基礎研究表明， sorcin是參與調節肌漿網RyR2介導Ca2+釋放通道活性的重要蛋白分子，其通過與RyR2胞漿段sorcin相應位點結合，抑制RyR2活性及其介導的肌漿網Ca2+釋放[4]；sorcin與RyR2間親和力的減弱可能引起血管平滑肌膜超極化及血管舒張，如F112L-sorcin突變可導致sorcin與RyR2間親和力減弱6倍，觸發血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC)鈣火花及瞬時外向鉀電流(STOCs)的形成[4，5]。 STOCs通過激活大電導鈣激活鉀通道(Large Conductance Calcium Activated Potassium Channel，BKCa)，促成休克晚期血管低反應性的形成[6, 7]。由此推測，失血性休克時外周血管可能發生sorcin與RyR2解離，并可能與休克晚期血管低反應性的發生有關。

本研究通過建立大鼠失血性休克模型，觀察失血性休克不同時期sorcin在VSMC胞漿及質膜的表達變化、sorcin-RyR2復合子形成和解離情況及其與休克血管異常反應性之間的關系，為尋求休克時血管低反應性恢復劑提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物和試劑

SD大鼠(體重200±20g，雌雄不限)由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供(動物合格證號：SYXK2002-032)；NE購自遠大醫藥(中國)有限公司，批號140507(2 mg/mL)，采用0.01mol/L HCl配制；戊巴比妥鈉、抗β-actin單抗購自Sigma-Aldrich公司(美國)；Supersignal發光增強試劑盒購自Pierce公司(美國)；Protein G、抗RyR2抗體、抗sorcin抗體購自Santa Cruz公司(美國)。其它相關試劑為國產分析純。

1.2分組及失血性休克模型

采用隨機數字表法將實驗大鼠分為對照組(n=12)和模型組(n=24)。模型組參照文獻[8]建立失血性休克大鼠在體模型：實驗前，大鼠禁食12h，自由飲水，建模當日戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉后，右側股動脈插管并接血壓計，肝素鈉500U/kg抗凝，術畢血壓穩定10min后開始放血，在10min內將平均動脈壓(MAP)降至40mmHg為失血性休克成模，并在此水平分別維持30min(n=12，休克早期組)和2h(n=12，休克晚期組)。對照組不行手術，普通飼養。

1.3觀察指標及其檢測方法

1.3.1離體血管張力：各組大鼠開腹取出整個腸組織，在解剖顯微鏡下剝離腸系膜上動脈主干及其1-2級分支，并清除周圍結締組織。動脈主干切取1-2個血管環，余下組織用于蛋白提取(見后述)。將血管環置于Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L：NaCl 118、 KCl 4.7、 NaHCO325、 KH2PO41.03、

MgSO4·7H2O 0.45、CaCl22.5、EDTA 0.001、glucose 11.1，pH 7.4)。在解剖顯微鏡下將血管環懸掛于一對不銹鋼絲上，一端置于固定柱，另一端與張力換能器(PowerLab，澳大利亞)相連，浸于注有K-H液的離體器官灌流浴槽中(37℃恒溫)孵育，持續通氧。待血管張力平衡后，記錄NE誘導血管環收縮曲線。血管環對NE(10-9-10-5mol/L)的收縮反應采用濃度累計法測定，即依次加入終濃度為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的NE，記錄早、晚休克組不同NE濃度下血管環收縮反應的變化，以加NE后血管環的收縮力與血管環初始張力的差值作量-效曲線，以量-效曲線及10-5mol/L NE誘導的最大收縮力(Emax，g)評價血管對NE的收縮反應性[1]。

1.3.2胞漿及質膜蛋白的提取：參照本實驗室方法[9]進行血管平滑肌胞漿及質膜蛋白的提取。將去內皮血管組織置于預冷蛋白裂解液中(mM: Tris-HCl 20、EDTA 2、EGTA 1、β-巰基乙醇 0.1%、NaF 10、Na3VO41、protein kinase inhibitor colktail pit)，于冰浴中剪碎組織并勻漿，收集上清置冰浴中凍融1h；上清經1 000g離心10min(4℃)，取上清再16 000g離心30 min (4℃)，收集上清即為胞漿總蛋白；將沉淀用質膜蛋白裂解液(mM: Tris-HCl 20、EDTA 2、EGTA 1、β-巰基乙醇 0.1%、NaF 10、Na3VO41、TritonX 100 1%、SDS 0.1%)溶解后，經16 000g離心20 min(4℃)，收集上清即為質膜總蛋白。采用Brad-ford法進行蛋白定量。

1.3.3胞漿和質膜sorcin蛋白表達： 采用Western blotting(WB)檢測各組大鼠血管平滑肌sorcin的表達。參照文獻[10]，取等量樣品蛋白(120μg/道)經15% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜，轉移完畢后用5% 脫脂奶粉室溫封閉4 h后加入抗sorcin單抗(1∶800)室溫孵育4 h，再加入辣根酶標記二抗(1∶10 000)室溫孵育1h，將待測硝酸纖維素膜置于supersignal發光增強試劑中反應2min-3min后，迅速用塑料膜包裹硝酸纖維素膜，與X-ray膠片一同放入暗盒中曝光2min-5min，再將膠片顯影、定影，確定蛋白條帶的相應分子量。將膠片置于圖像分析儀(Bio-Rad Gel 2000型,美國)中，對目標條帶進行掃描及灰度分析。

1.3.4Sorcin-RyR2復合子檢測： 采用免疫共沉淀聯合免疫雜交檢測Sorcin-RyR2復合子的形成及解離情況。收集各組總蛋白(500μl)，加入抗RyR2單抗(5μg)，4℃振搖(over-night)，繼續加入protein G (20 μl) 4℃振搖5 h后，2 500 g離心10 min(4℃)，棄上清；采用RIPA洗滌3次后，加入RIPA和上樣緩沖液(4∶1)，100℃煮5 min。常規SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜，加入抗sorcin單抗(1∶1 000)，室溫孵育4 h，再加入辣根酶標記二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，將待測硝酸纖維素膜置于supersignal發光增強試劑中反應2min-3min后，迅速用塑料膜包裹硝酸纖維素膜，與X-ray膠片一同放入暗盒中曝光2min-5min，再將膠片顯影、定影，確定蛋白條帶的相應分子量。將膠片置于圖像分析儀中，對目標條帶進行掃描及灰度分析。

1.4統計學處理

2結果

2.1各組大鼠腸系膜動脈對NE的反應性

結果顯示，休克早期組大鼠腸系膜動脈對NE的收縮反應性顯著高于對照組，表現為NE的量-效曲線明顯左移，10-5mol/L NE引起血管Emax由0.72±0.15g升至1.11±0.28g(t=1.931，P<0.05)；休克晚期組腸系膜動脈對NE的收縮反應性較對照組明顯降低，表現為NE的量-效曲線明顯右移，10-5mol/L NE引起血管Emax由0.72±0.15g降至0.50±0.11g(t=1.874，P<0.05)，與我們以往的報道[1]一致。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2各組大鼠腸系膜動脈平滑肌sorcin在胞漿及質膜的表達

結果顯示，各組sorcin總表達量差異無統計學意義(F=5.607，P>0.05)；失血性休克早期組，sorcin在血管平滑肌胞漿及質膜中的表達無顯著差異(t=1.131，P>0.05)，而晚期組胞漿sorcin表達升高，質膜sorcin表達降低，兩者差異有統計學意義(t=1.868，P<0.05)。提示失血性休克晚期，sorcin可從肌漿網向胞漿轉位。見圖2。

注：與休克早期組比較，*P<0.01

2.3休克早期組和晚期組sorcin-RyR2復合子表達

結果顯示，失血性休克早期組與對照組大鼠腸系膜動脈平滑肌sorcin-RyR2復合子表達差異無統計學意義(t=1.319，P>0.05)，晚期組sorcin-RyR2復合子表達較對照組顯著減少，差異有統計學意義(t= 2.067，P<0.05)，見圖3。

2.4休克晚期組大鼠Sorcin胞漿水平與腸系膜動脈對NE反應性的相關性分析

相關分析結果顯示，休克晚期組大鼠sorcin在胞漿的表達與腸系膜動脈對NE反應性(收縮力)呈顯著負相關(r=-0.983,P<0.01)；休克早期組大鼠sorcin在胞漿的表達與腸系膜動脈對NE反應性未見顯著相關性(r=0.087,P>0.05)。見圖4。

注：與對照組比較，*P<0.05

圖4　失血性休克晚期組大鼠腸系膜動脈平滑肌胞漿sorcin

3討論

嚴重創傷/失血性休克后血管功能障礙的發生是導致臨床患者血壓持續下降、器官灌流不足及機體死亡的重要原因之一。肌漿網由RyR介導的內鈣釋放是調控血管平滑肌舒-縮反應的重要機制之一，其在失血性休克血管反應性異常發生中的作用研究甚少。

分布于血管平滑肌的sorcin調節著血管平滑肌細胞興奮-收縮偶聯。生理狀態下，位于胞漿的sorcin選擇性結合RyR2并維持RyR2/鈣釋放通道處于閉合狀態，從而抑制RyR2的基礎活性[11]。本研究結果顯示，在失血性休克大鼠腸系膜動脈去內皮后，sorcin的表達發生明顯轉位，即在失血性休克晚期(2h)，sorcin在胞漿的表達明顯升高，而在質膜的表達顯著降低；同時發現，失血性休克晚期大鼠腸系膜動脈血管平滑肌sorcin-RyR2復合子表達水平較對照組顯著降低。表明在失血性休克晚期發生了sorcin與RyR2解離及從肌漿網向胞漿轉位；而且sorcin在胞漿中的表達升高與血管反應性降低呈顯著負相關。而在失血性休克早期(30min)，sorcin在胞漿及質膜的表達、sorcin-RyR2復合子水平以及血管對NE的收縮反應性均與對照組差異無統計學意義。

已有研究顯示，sorcin從RyR2的解離可刺激RyR2通道活性及RyR2介導肌漿網內鈣釋放的增加，通過觸發鈣火花及STOCs形成[4，5]，導致VSMC膜BKCa通道的激活[6]；我們以往的研究也表明，BKCa通道的過度激活促成了休克晚期血管低反應性的形成。因而認為sorcin從RyR2解離可能與失血性休克后血管低反應性的形成有關。至于sorcin從RyR2解離在觸發休克血管低反應性形成中的可能機制，以及休克晚期觸發sorcin與RyR2解離的上游調控分子，均有待進一步探討。

綜上，失血性休克晚期，大鼠腸系膜動脈sorcin與肌漿網RyR2解離所導致的sorcin從肌漿網質膜向胞漿轉位，可能是促成失血性休克晚期血管低反應性形成的重要原因。

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周榮(1971-)，女，漢族，醫學博士，副研究員，研究方向為休克血管功能障礙發生機制及防治

參考文獻

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The Translocation of Sorcin and the Correlating Analysis with the Changes of Vascular Reactivity after Hemorrhagic Shock

ZHOU Rong，DING Xiao-li，LIU Liang-ming#

State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combained Injury, Second Department of Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China；#Corresponding author

【Abstract】Objective: To explore the expression and distribution of sorcin in superior mesenteric artery (SMA) during different stage after hemorrhagic shock and its role in the regulation of vascular reactivity after hemorrhagic shock. Method: 30 SD rats were divided into two groups, twelve as a nonsurgical control group and the rest of the rats were classified as hemorrhagic shock model group that suffered from femoral artery bleeding method (arterial pressure is 40mmHg). The model group rats were divided into the early stage of shock group (30min) and the late stage of shock group (2h). Isolated mesenteric arteries were isolated from each group. The reactivity of mesenteric artery to NE was detected by using in vitro organ tension test. The expression and distribution of sorcin protein in mesenteric artery smooth muscle was detected by using Western Blotting (WB). The expression of sorcin-RyR2 was detected by using Co-immunoprecipitation combined with WB. Then analyze the correlation between the level of sorcin protein and the reactivity of mesenteric artery to NE in the shock rats.Results: During the early stage (30min) after hemorrhagic shock, the vascular reactivity to NE increased significantly, while the vascular reactivity to NE decreased during late stage (2h), which suggested that there was bi-phasic vascular reactivity to NE in SMA during different stage after hemorrhagic shock. The total expression of sorcin had no significant changes but the distribution of sorcin in cytoplasm and plasmalemma fraction of VSMC changed significantly, characterized with the expression of sorcin in cytoplasm and in plasmalemma had no significant changes during the early stage (30min) after hemorrhagic shock, while the expression of sorcin in cytoplasm fraction was upregulated but its expression in plasmalemma fraction decreased significantly during the late stage (2h) after hemorrhagic shock. Immunoprecipitation analysis showed that formation of sorcin-RyR2 complex decreased during the late stage but not during the early stage after hemorrhagic shock. The correlation analysis showed that the increased expression of sorcin in cytoplasm closely associated with the blunted vascular hyporeactivity to NE during the late stage after hemorrhagic shock. Conclusion: At late stage after hemorrhagic shock, sorcin translocated from cytoplasm to plasmalemma in superior mesenteric artery in rat. The dissociation of sorcin from RyR2 at least partly associated with the development of vascular hyporeactivity to NE during the late stage after hemorrhagic shock.

【Key words】Hemorrhagic shock; Vascular reactivity; Sorcin; Ryanodine receptor Ⅱ; Rat

通訊地址：430060 湖北省武漢市張之洞路9號《微循環學雜志》編輯部電話：027-88075389；

作者簡介：本文第一

[中圖分類號]R541.6+4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2016)01-0001-05

*[基金項目]國家自然科學基金(81100227、81370427)

本文2015-07-09收到，2015-12-20修回