唑來膦酸聯合培美曲塞對肺腺癌細胞的體外抗腫瘤作用

周洋，鄒華偉

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110022)

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唑來膦酸聯合培美曲塞對肺腺癌細胞的體外抗腫瘤作用

周洋，鄒華偉

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110022)

摘要：目的探討唑來膦酸聯合細胞毒性藥物培美曲塞是否有協同抗肺腫瘤作用。方法 將不同濃度(0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/mL)唑來膦酸和不同濃度(0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)培美曲塞以及兩藥聯合(1、10 μg/mL唑來膦酸+0.01 μg/mL培美曲塞)作用于體外培養的A549肺腺癌細胞株24、48、72 h,采用MTT法檢測細胞生長抑制率,流式細胞術檢測細胞凋亡率。透射電子顯微鏡觀察細胞形態學改變。結果唑來膦酸及培美曲塞單藥對A549細胞株生長有抑制作用，呈劑量-時間依賴性(P均<0.05)；唑來膦酸聯合培美曲塞能夠增強對細胞增殖的抑制作用(P<0.05)。兩藥聯合用藥時的細胞凋亡率高于單藥(P均<0.05)。結論 唑來膦酸及培美曲塞對A549細胞株均具有生長抑制及誘導凋亡作用，二者聯用有協同抗肺腫瘤作用。

關鍵詞：肺腫瘤；唑來膦酸；培美曲塞；細胞凋亡

肺癌已經成為我國癌癥相關死亡的首要病因，占所有癌癥死亡的22.7%，到2025年可能會達到100萬[1]。目前，針對肺癌的治療手段主要包括化療、放療和外科手術治療等。臨床資料顯示，肺癌骨轉移占晚期肺癌患者的50%~70%[2]。肺癌發生骨轉移后1年生存率為5.3%，2年生存率為2.1%，很少超過3年，是造成肺癌死亡的重要原因[3]。唑來膦酸是第三代含氮的雜環雙膦酸鹽藥物，是第一個被證實對所有類型惡性腫瘤骨轉移均有廣譜療效的雙磷酸鹽藥物[4]。臨床前研究[5]提示，唑來膦酸除了對骨吸收有抑制作用外，還具有直接的體內外抗腫瘤作用，可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制其增殖和侵襲。研究[6]發現唑來膦酸可使癌癥患者生存期受益，但其直接抗腫瘤作用及機制尚待進一步的研究闡明。2011年4月～2013年12月，我們進行了唑來膦酸對A549肺腺癌細胞株生長抑制和凋亡作用的體外實驗，并觀察其與培美曲塞聯用是否具有協同抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1材料細胞系：人肺腺癌細胞株A549由中國醫科大學腫瘤研究所惠贈。A549細胞株接種于含10%胎血清的RPMI1640培養基中，置5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱中培養。細胞貼壁生長，以0.125%的胰蛋白酶消化傳代，每1~2天換液1次。唑來膦酸(商品名擇泰)由瑞士諾華公司饋贈，培美曲塞(商品名力比泰)由美國禮來公司饋贈，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，RPMI1640細胞培養液、胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司，凋亡試劑盒(AnnexinV/PI)購自北京寶賽試劑公司，細胞培養箱購自日本SANYO公司，流式細胞儀購自美國Becton Dickson公司，酶聯免疫測定儀購自美國BIORAD公司。

1.2細胞生長抑制率的檢測取對數生長期的A549細胞，調節細胞濃度為每孔1×106/mL，接種于96孔培養板，每孔加液量200 μL。分別加入用去離子水溶解的不同濃度的唑來膦酸：0.1、0.5、1、5、10、50、100 μmol/L以及不同濃度的培美曲塞：0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL，不加藥組為空白對照，各設3個復孔。分別繼續培養24、48、72 h后加入MTT試劑(5 mg/mL)20 μL，空白調零組加入PBS液20 μL，繼續培養4 h后吸出上清，每孔加DMSO溶液150 μL，置水平搖床上搖15 min。在酶聯免疫測定儀上選擇波長490 nm，空白孔調零，測定各孔波長490 mm處的吸光度(A)。計算細胞生長抑制率，抑制率=(1-實驗組A平均值/對照組A平均值)×100%。根據實驗結果取唑來膦酸IC50濃度及培美曲塞IC20濃度，用相同方法測定唑來膦酸聯合培美曲塞作用72 h對肺癌A549細胞的生長抑制率。

1.3細胞凋亡率的測算 采用流式細胞術。取對數生長期的A549細胞，以1×106/mL細胞數接種于培養瓶中，24 h后換液。設對照組(不加藥物，只加入等體積的溶劑)、唑來膦酸組(10 μmol/L)、培美曲塞組(0.01 μg/mL)，以及唑來膦酸(10 μmol/L)+培美曲塞(0.01 μg/mL)組(聯合組)。每組均重復3瓶。繼續培養72 h后收集所有懸浮及貼壁細胞，藥物作用72 h后，收集四組細胞，根據Annexin V-FITC試劑盒使用說明分離細胞，加入Annexin V-FITC 10 μL混勻，常溫避光反應15 min，再加入300 μL結合緩沖液以及5 μL PI染料，各組細胞用流式細胞儀分別進行檢測并計算凋亡率。

1.4細胞形態的觀察取對數生長期的A549細胞，以1×106/mL細胞數接種于培養瓶中，24 h后換液。分組及處理同1.3。Hanks液清洗各處理組細胞1次，胰酶消化，用4 ℃離心機收集細胞，用0.1 mmol/L PBS液漂洗兩次；細胞懸浮于2.5%戊二醛中固定30 min，PBS液漂洗兩次；細胞懸浮于1%鋨酸中固定1 h，再用0.1 mmol/L PBS液漂洗兩次；4%醋酸鈾水溶液染色30 min，50%、70%和90%乙醇依次脫水各15 min，100%乙醇脫水20 min，100%丙酮脫水20 min兩次；將細胞置于無水丙酮包埋劑(1∶1)中置換30 min，并振蕩2 h；包埋劑純浸2 h，純包埋劑包埋；并置烘箱內聚合，37 ℃中24 h，45 ℃中24 h，60 ℃中48 h。超薄切片(約120 nm)，4%醋酸鈾染色20 min，枸櫞酸鉛染色5 min。高壓80 kV透射電子顯微鏡下觀察和照相。

2結果

2.1不同濃度唑來膦酸對肺腺癌A549細胞系生長的抑制作用與空白對照比較，不同濃度的唑來膦酸能夠抑制腫瘤細胞生長，且呈時間依賴性及劑量依賴性(P均<0.05)。唑來膦酸對A549細胞作用72 h的IC50值為12.092 μmol/L。見表1。

表1　不同濃度唑來磷酸不同時間對A549細胞

注：與空白對照比較，*P﹤0.05;其余不同時間、不同濃度唑來膦酸之間兩兩比較，P均﹤0.05。

2．2 不同濃度培美曲塞對肺腺癌A549細胞系生長的抑制作用隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，培美曲塞對A549細胞的生長抑制率逐漸增加(P均<0.05)，培美曲塞對A549細胞作用72 h的IC20值為0.098 μg/mL。見表2。

表2　不同濃度培美曲塞不同時間對A549細胞體外生長

注：與空白對照比較，*P﹤0.05；其余不同時間、不同濃度培美曲塞之間兩兩比較，P均﹤0.05。

2.3 唑來膦酸和(或)培美曲塞對A549細胞的生長抑制作用見表3。

表3　唑來磷酸和(或)培美曲塞對A549細胞的

注：與空白對照比較，*P﹤0.05；與相應單藥比較，#P﹤0.05。

2.4各組細胞凋亡率比較唑來膦酸組藥物作用72 h后，細胞凋亡率為17.4%，培美曲塞組細胞凋亡率為29.3%，聯合組細胞凋亡率為41.7%，聯合組細胞凋亡率高于唑來膦酸和培美曲塞組(P均<0.05)。

2.5各組細胞形態學表現對照組細胞形態大小正常，核膜完整，染色質無濃縮、邊聚，細胞器多，胞膜表面皺褶較多；唑來膦酸組、培美曲塞組、聯合組均呈現凋亡期形態學改變：胞質濃縮、細胞器明顯減少、胞質空泡化，胞膜表面皺褶減少、胞膜完整、核型不規則，染色質固縮成塊、聚在核膜周邊或散落在細胞核內。

3討論

唑來膦酸治療非小細胞肺癌骨轉移可顯著延遲骨相關事件出現、降低骨相關事件風險，是惟一被批準用作有效預防或延緩肺癌骨轉移(包括溶骨和成骨)骨相關事件發生的藥物。其主要作用機制是抑制破骨細胞活性、骨吸收、破骨細胞向腫瘤病變部位的募集和黏附，抑制焦磷酸鹽合成酶，阻止破骨細胞分化、誘導其凋亡[7]。最近的動物實驗與臨床前實驗研究表明，唑來膦酸不僅是一個治療骨轉移的藥物，其對乳腺癌、腎癌、肺癌等腫瘤還有直接的抗腫瘤作用[8]。近年研究[9]發現，唑來膦酸既有影響腫瘤細胞的黏附與入侵、增殖、凋亡的直接作用，又有抗血管生成、對γδT細胞的免疫調節作用，抑制甲羥戊酸途徑的間接作用，并能以協同作用方式增強細胞毒化療藥物的抗腫瘤作用。

本研究結果表明，唑來膦酸對肺癌A549細胞的生長具有抑制作用，且呈時間和劑量依賴性。流式細胞儀檢測結果提示唑來膦酸具有誘導肺癌A549細胞凋亡的作用。這種作用在乳腺癌、腎癌、骨肉瘤等細胞株研究中已有報道[10]。就目前所知，唑來膦酸是通過抑制甲羥戊酸途徑中的小GTP酶的異戊烯化，從而影響下游信號的傳導。唑來膦酸抑制Ras基因的法尼基化，阻止其和細胞膜相互作用，下調Ras信號系統[11]。最近研究發現，含氮雙磷酸鹽還可以誘導一種獨特的三磷酸腺苷類似物Apppi產生，其可以直接誘導細胞凋亡[12]。另外Mahtani等[13]報道，唑來膦酸對腎癌細胞株的凋亡是依賴Caspase途徑引發凋亡，但誘導凋亡經常不總是伴隨Caspase激活。Aoyagi等[14]在唑來膦酸治療骨肉瘤細胞中發現了一種新的誘導凋亡機制，不依賴于Caspase的激活，細胞死亡伴隨著Bax增多、Bcl-2表達減少、細胞凋亡誘導因子和核酸內切酶G移位 。Li等[15]研究證實，唑來膦酸對肺癌95D細胞的增殖抑制作用是通過細胞凋亡相關基因ERK、Bcl-2和survivin的表達水平下降，Bax的表達水平增高而實現的。國內外研究表明，唑來膦酸對肺癌也可能具有直接的抗腫瘤作用，但確切的機制還有待進一步探討。

化療在肺癌的治療中占重要地位，是肺癌全身治療中最為成熟的方法。有研究[16]結果提示，盡管新的化療藥物不斷問世，第3代含鉑方案仍不能明顯改善晚期肺癌患者的生存期，中位生存時間為7.4~8.3個月，1年生存率為31%~36%。培美曲塞是一種具有多個作用靶點的新型抗葉酸代謝類藥物，通過抑制嘧啶和嘌呤合成過程中的多種酶，發揮抑制腫瘤DNA合成的作用，特別是非鱗狀細胞癌非小細胞肺癌(NSCLC)。2004年，培美曲塞被收入ESMO、ASCO、NCCN發表的NSCLC治療指南，目前已被批準單藥維持治療非鱗狀細胞癌NSCLC，與順鉑聯用作為晚期非鱗狀細胞癌NSCLC的一線化療藥。本實驗研究結果顯示，不同濃度的唑來膦酸及培美曲塞均對肺腺癌細胞A549具有明顯的生長抑制作用和誘導凋亡作用，呈劑量和時間依賴性，且唑來膦酸與培美曲塞聯合組上述作用明顯增強。提示唑來膦酸聯合細胞毒藥物培美曲塞對A549細胞具有協同抗腫瘤作用。

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(收稿日期：2015-08-04)

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0035-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.012

通信作者：鄒華偉(E-mail:zouhw@sj-hospital.org)