甘肅地區乙型肝炎病毒基因型分布研究*

何莉莉，張興旺，王　平，張哲梅，居　軍

(1.甘肅衛生職業學院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院檢驗中心，甘肅蘭州 730000)

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·臨床研究·

甘肅地區乙型肝炎病毒基因型分布研究*

何莉莉1，張興旺2，王平2，張哲梅2，居軍2

(1.甘肅衛生職業學院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院檢驗中心，甘肅蘭州 730000)

摘要:目的分析甘肅地區乙型肝炎病毒(HBV)的基因型分布。方法采用型特異性引物-聚合酶鏈式反應(SSP-PCR)技術對300例HBV DNA陽性患者進行HBV基因分型。結果在300份血清標本中，279份標本被成功分型，其中基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未確定型別21份，占7.0%。不同基因型HBV感染患者間性別、年齡分布及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；B型HBV感染患者乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性率(40.7%)略高于C型患者(35.5%)，差異無統計學意義(P>0.05)。結論甘肅地區HBV基因型包括B、C、B/C、C/D型，其中C型為優勢基因型。

關鍵詞:乙型肝炎病毒；基因型；特異性引物；聚合酶鏈式反應

乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布具有明顯的種族和地域性差異，我國主要以B、C型感染為主，其中北方以C基因型為主，南方以B基因型為主。而甘肅省位于我國西北地區，屬于HBV感染高流行區，其HBV基因型分布值得關注。本研究旨在分析甘肅地區HBV基因型的構成情況，為指導臨床病情分析及治療提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料2008年6月至2011年7月甘肅省人民醫院肝病和消化科門診、住院患者及甘肅省腫瘤醫院患者共300例，HBV DNA定量檢測均為陽性，其中男220例、女80例，年齡15～70歲，40%來自甘肅省蘭州市，60%來自甘肅省除蘭州市以外的地區。納入的所有患者診斷均符合2000年第10次全國(西安)病毒性肝炎會議修訂的病毒性肝炎診斷標準[1]，均排除其他病毒性肝炎及自身免疫性肝炎。

1.2方法

1.2.1標本采集與處理抽取受檢者靜脈血2 mL，室溫放置30 min自然凝固，3 000 r/min離心10 min，離心半徑為8 cm，吸取血清，-20 ℃保存備用。

1.2.2HBV DNA的定量檢測HBV DNA定量檢測采用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)，于LightCycler熒光定量PCR儀(德國羅氏公司)上檢測；定量結果大于1.00×103copies/mL則判為陽性。核酸擴增和溫度循環條件設置嚴格按照廠商試劑說明書進行。

1.2.3HBV血清學標志物(HBV-M)的檢測HBV-M檢測采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、乙型肝炎核心抗體(HBcAb)檢測使用上海科華公司試劑在全自動酶免分析儀(瑞士Tecan公司)上運行測試，反應程序設置嚴格按照廠商試劑說明書進行，同時做室內質控。

1.2.4HBV基因分型采用特異性引物-PCR(SSP-PCR)技術進行檢測，引物參考文獻[2]方法，根據前S1基因到S基因中的保守序列設計出10條引物，其中2條外引物，8條內引物，包含6種基因型。每條內引物具有型特異性，使得各種基因型PCR產物大小各不相同。所用引物序列見表1，由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.5HBV DNA的提取取待測HBV血清標本各100 μL，加入100 μL核酸提取液A，振蕩混勻15 s，1 300 r/min離心10 min，棄上清。再加入50 μL核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10 s，100 ℃保溫10 min，13 000 r/min離心2 min，取上清液作為PCR擴增的模板。

1.2.6PCR擴增反應(1)以HBV DNA為模板，用外引物P1與P2進行第1輪PCR。PCR反應體系(25 μL)如下：Taq預混酶12 μL，50 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水10 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，循環30次；68 ℃延伸10 min，結束反應。同時以蒸餾水為模板擴增作為陰性對照。(2)以第1輪PCR產物為模板，分別以A組引物(B2、BA1R、BB1R、BC1R)和B組引物(B2R、BD1、BE1、BF1)為內引物進行第2輪PCR，檢測HBV DNA基因型A、B、C、D、E、F。PCR反應體系(25 μL)如下：Taq預混酶12 μL，50 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水10 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸10 min，結束PCR反應。同時以蒸餾水為模板擴增作為陰性對照。

1.2.7基因型的判斷將第2輪PCR產物分別在1.5%瓊脂糖中進行電泳后，在紫外凝膠成像系統拍照，根據PCR擴增產物片段大小來判斷基因型。

1.3統計學處理采用SPSS18.0統計軟件進行數據處理與統計分析，計數資料以例數或百分率表示，采用χ2檢驗進行比較分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1HBV基因型的構成在300份血清標本中，279份標本被成功分型，其中基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未確定型別21份，占7.0%。基因C型所占百分比高于其他3種基因型，差異有統計學意義(P<0.05)。隨機選取基因B、C 型各5份樣品及混合基因型C/D 4份樣品，均送至大連寶生物工程有限公司進行S序列測序，結果完全符合。

2.2分型成功的標本來源患者特征不同基因型HBV感染患者間性別、年齡分布及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；B基因型患者HBeAg陽性率(40.7%)略高于C基因型患者(35.5%)，但差異無統計學意義(P>0.05)。

3討 論

筆者采用SSP-PCR對甘肅地區HBV進行基因型鑒定，在300份血清標本中，279份標本被成功分型，基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未確定型別21份，占7.0%；未發現基因型A、E、F存在。結果說明甘肅地區和全國HBV基因型分布相似，也是以B、C型為主，且兩者中C型所占百分比更高，基因C型為優勢基因型，這與我國有關HBV基因型的報道一致[3-4]。本研究還發現了4例HBV混合基因型C/D感染患者，這可能與甘肅地區的地理位置及少數民族的存在有一定關系。混合基因型B/C和C/D的存在，可能原因是HBV感染者免疫功能低下而獲得了二次感染，這有待進一步研究。此外，21例患者未確定基因型別，可能原因分析如下：(1)可能為G或H型；(2)近年來乙型肝炎治療中新型抗病毒藥物的應用導致病毒發生基因突變，而本試驗所用引物不適用于突變基因的檢測；(3)樣品在采集和保存過程中DNA降解。具體原因仍有待于進一步研究。

在本研究中,不同基因型HBV感染患者間性別、年齡分布及ALT水平比較均無明顯差異。B、C基因型HBV感染患者HBeAg陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05),與國內學者報道存在差異[5]。隨著研究的深入,越來越多的研究表明HBV基因型與乙型肝炎的發病機制、疾病轉歸、抗病毒療效有密切關系[6-10]。但是，目前關于HBV基因型與HBeAg陽性率、HBV DNA載量、發病年齡及肝功能指標相關性的研究結論不完全一致，尚無定論。除HBV基因型，HBV感染后疾病進程及轉歸還與抗病毒治療、機體免疫狀態及宿主遺傳因素等密切相關，而HBV基因型只是影響疾病進程的重要因素之一。

綜上所述，甘肅地區慢性乙型肝炎基因型分布構成包括B、C、B/C和C/D混合型，其中基因C型為優勢基因型，符合我國北方城市HBV基因型的流行病學特征。下一步筆者將擴大樣本量，進行基因亞型和不同基因型的乙型肝炎患者轉歸相關性研究，為甘肅地區的乙型肝炎防治提供更多的實驗室依據。

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基金項目：甘肅省技術研究與開發專項計劃項目(0709TCYA025)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.028

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0647-02

(收稿日期：2015-09-20)