基于啤酒酵母二次發酵啤酒糟條件響應面優化研究

賓冬梅,黃河清濤,楊 燦,易 誠,伍渡清,饒力群

(1.衡陽師范學院 生命科學與環境學院，湖南 衡陽 421008；2.湖南農業大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.燕京啤酒(衡陽)有限公司，湖南 衡陽 421008)

基于啤酒酵母二次發酵啤酒糟條件響應面優化研究

賓冬梅1,黃河清濤2,楊 燦1,易 誠1,伍渡清3,饒力群2

(1.衡陽師范學院 生命科學與環境學院，湖南 衡陽 421008；2.湖南農業大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.燕京啤酒(衡陽)有限公司，湖南 衡陽 421008)

為提高發酵啤酒糟高蛋白產量，以一次發酵的黑曲霉和木霉雙菌發酵的啤酒糟為原料，以粗蛋白含量為指標，以枯草芽孢桿菌分別與啤酒酵母配伍進行二次混菌發酵，并利用響應面進行分析優化，結果表明：啤酒酵母和枯草芽孢桿菌二次發酵啤酒糟對應的最佳條件為溫度35 ℃，接種量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢桿菌接種量比為5∶1，添加硫酸銨3.46 %，尿素添加量2 %，發酵時間4天，理論粗蛋白質含量38.11 %。

啤酒糟；混菌；二次發酵；響應面；高蛋白

啤酒糟是啤酒生產的殘留物質，主要含有纖維素、淀粉及蛋白質[1]等，因含有大量水分則容易產生變質。目前啤酒企業絕大部分作為粗飼料銷售，而因為纖維含量過高、適口性差，不能完全被養殖戶接收[2-5]，很多企業當作廢棄物處置，既浪費了資源，還污染了環境[6]。為了能夠更高效利用啤酒糟，優選出產生纖維素酶的最佳發酵配伍方案，選定發酵菌種。

目前，國內外應用于生產纖維素酶的菌種主要有木霉、曲酶等[7-11]，全球纖維素酶市場中的20 %是來自曲霉屬和木霉屬[12]。本文以一次發酵的黑曲霉和木霉雙菌發酵，以料水比為1∶0.5，黑曲霉比木霉接種量為5∶5的混菌接種20 %，32 ℃下培養3天的啤酒糟為原料，以粗蛋白含量為考察指標，使用啤酒酵母菌和枯草芽孢桿菌進行第二次混菌發酵，并通過響應面優化得到啤酒糟第二次發酵的最佳工藝，生產蛋白啤酒糟飼料，達到立體開發啤酒糟的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料

新鮮啤酒糟(燕京啤酒(衡陽)有限公司提供)

1.1.2 菌種

啤酒酵母NO.1(Sac-charomyces cerevisiae)和枯草芽孢桿菌NO.1(Bacillus subtilis)由湖南農業大學生科院實驗室提供。

1.1.3 培養基

斜面(平板)培養基：麥芽汁瓊脂培養基；種子培養基：酵母菌使用麥芽汁培養基，枯草芽孢桿菌使用牛肉膏蛋白胨培養基(1 L蒸餾水+20 g葡萄糖+15 g蛋白胨+5 g氯化鈉+0.5 g牛肉膏+20 g瓊脂)；發酵培養基：啤酒槽與麩皮的比例為8∶2。

1.1.4 實驗試劑

硫酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、蛋白胨、瓊脂、硫酸銅、尿素、無水乙醇，均為分析純。

1.1.5 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫水槽、紫外-可見分光光度計、電子天平、電熱恒溫鼓風干燥箱、電熱恒溫水浴鍋、凱氏定氮儀、冷凍高速離心機、粗纖維測定儀、恒溫培養搖床、超凈工作臺、光照培養箱、高壓滅菌器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養

斜面孢子的培養：將菌株轉接到新鮮的斜面試管，于30 ℃培養3 d。

種子制備：往250 mL三角瓶中倒入150 mL種子培養基，設置115 ℃滅菌16 min，等待冷卻后接入新鮮成熟菌種斜面孢子一環，在搖床中30 ℃、150 r/min的條件下培養3 d。

發酵培養：取發酵培養基30 g加入到250 mL的燒杯中，在115 ℃滅菌15 min后，培養條件為含水量2倍，混菌接種20 %，其中黑曲霉比木霉接種量為6∶4，在30 ℃下培養3 d后，再接種一定量酵母菌和枯草芽孢桿菌，在一定溫度下培養若干天。

1.2.2 蛋白質測定

粗蛋白含量的檢測，使用飼料中粗蛋白的測定方法(GB/T 6432-94)

稱0.5-1 g試樣，放入到250 mL玻璃容器中，加入蒸餾水50 mL后，煮沸30 min。再加入10 %硫酸銅溶液和2.5 %氫氧化鈉溶液各20 mL，并不停攪拌。靜置2 h后定量濾紙過濾。沉淀用70 ℃的熱水進行洗滌。最后沉淀在65 ℃烘干2 h。再把沉淀物放入到消化管中，加入混合催化劑6.4 g，硫酸12 mL，在420 ℃的消化爐上消化1 h。取出等待冷卻后加入30 mL蒸餾水。

將帶有消化液的管子插入蒸餾裝置，其末端要浸入錐形瓶的吸收液內，吸收液用25 mL硼酸，加入2滴混合指示劑，消煮管中加入50 mL氫氧化鈉溶液蒸餾至吸收液體積達到100 mL，取出錐形瓶，冷凝管末端的蒸餾水沖洗液需要流入錐形瓶內。

吸收液的滴定：0.1 mol/L的標準鹽酸溶液滴定溶液由藍綠色變為灰紅色。

稱0.5 g蔗糖代替試樣進行空白測定，消耗滴定液(0.1 mol/L鹽酸)的體積不能超過0.2 mL。

計算公式：

粗蛋白質

其中V2—滴定試樣所需標準酸溶液體積，mL；V1—滴定空白所需標準酸溶液體積，mL；C—鹽酸標準溶液濃度，mol/L；m—試樣質量，g；V—試樣分解液總體積，mL；V3—試樣分解液蒸餾用體積，mL；0.0140—每毫克當量氮的克數；6.25—換算成蛋白質的平均系數。

1.2.3 響應面實驗方法

Plackett-Burman設計：在前期試驗的基礎上，選擇可能對發酵產物粗蛋白質產生的影響因素，包括菌種比、硫酸銨、時間、尿素、接種量、溫度。為了對這6個因素進行全面考察，以粗蛋白質含量作為響應值Y，利用Plackett-Burman設計，察各因素的主效應和交互作用(見表1)。

表1 Plackett-Burman設計因素及水平

2 結果與分析

2.1 啤酒酵母的發酵條件優化

2.1.1 Plackett-Burman設計篩選主要的發酵影響因素

Plackett-Burman試驗設計及結果見表2。

表2 Plackett-Burman試驗方差分析結果

各因素系數估計和效應評價見表3。

表3 各因素影響的主效應分析

從表中可以看出，影響粗蛋白質含量的主要因子是溫度、硫酸銨、接種量，三者在α=0.05水平上，P<0.05，表明對釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合發酵啤酒糟的粗蛋白質含量有顯著影響(置信度>95%，)，其他因素在α=0.05水平上，P>0.05，表明對產物粗蛋白質含量影響不顯著。所以以溫度、硫酸銨、接種量進入下一步的響應面分析試驗。

2.1.2 響應面分析

響應面分析：根據Box-Behnken的中心組合設計原理，對Plackett-Burman試驗篩選的溫度、硫酸銨、接種量3個主要影響因素進行Box-Behnken設計，以粗蛋白質含量為響應值，設計3因素3水平共15個試驗點的響應面分析試驗，各因素的取值水平見表4，試驗結果見表5。

表4 主要影響因素及水平

表5 主要影響因素及水平

2.1.3 回歸方程的方差分析

根據試驗結果，利用 Minitab軟件進行各因素回歸擬合后得到回歸方程，方差分析見表6。

表6 回歸方程各項的方差分析

續表

來源自由度SeqSSAdjSSAdjMSFP溫度*溫度11.0306.0066.0061.110.340接種量*接種量1295.889301.602301.60255.850.001硫酸銨*硫酸銨17.9027.9027.9021.460.280交互作用327.07027.0709.0231.670.287溫度*接種量18.2378.2378.2371.530.272溫度*硫酸銨14.2034.2034.2030.780.418接種量*硫酸銨114.63114.63114.6312.710.161殘差誤差527.00227.0025.400失擬326.78626.7868.92982.960.012純誤差20.2150.2150.108合計14542.470

2.1.4 響應面直觀分析

RSA方法的圖形是接種量、硫酸銨量、溫度對應特定的響應值Y構成的一個三維空間在二維面上的等高圖，能夠直觀反映三因素對響應值的影響，從得到的應面分析圖(圖1)上可以找到接種量、硫酸銨量、溫度在發酵過程中的相互作用，確認合適的工藝條件。

選用實驗得到的最佳條件進行驗證試驗，3次平行試驗得到的平均粗蛋白含量為37.46 %，與理論值相差小于1 %，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性。其對應的最佳條件為溫度35 ℃，接種量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢桿菌接種量比為5∶1，添加硫酸銨3.46 %，尿素添加量2 %，發酵時間4 d，理論粗蛋白質含量38.11 %。

圖1 接種量、硫酸銨添加量和溫度對啤酒糟發酵產蛋白含量影響的響應面

2.5 各影響因素分析

2.5.1 發酵時間對產蛋白質的影響

在第二次發酵中，使培養基中蛋白質含量增高的是酵母菌的增殖，在前期發酵中，酵母菌以木霉、曲霉等一次發酵產生的還原糖類作為碳源，進行孢子的萌發、菌絲的生長；隨著發酵的持續進行，培養基中木霉、曲霉等一次發酵產生的還原糖類逐漸減少，同時隨著酵母菌體生物量逐漸增加，在發酵后期由于菌種的老化，反而會影響啤酒糟中的蛋白質含量。

2.5.2 菌液的接種量對產蛋白質的影響

顯然，接種量會直接影響產酶結果，接種量過少，菌種生長達到穩定期的時間較長，糖原的消耗增加，后期供酵母發酵的糖原不足，導致生產效率低； 接種量過多，前期糖原消耗急劇增加，會導致后期營養物質供不應求。

2.5.3 溫度對產蛋白質的影響

溫度是微生物生長的最重要的影響因素之一。各種菌種都有其最相適宜的生長溫度。在 0 ℃以下，菌體生長緩慢甚至處于休眠狀態，溫度過高可能使其生長繁殖受抑制甚至死亡?；炀l酵中存在多種菌種，每種菌生長發酵的適宜溫度又不盡相同。選擇合適的溫度，使各菌種之間互相補充互相促進，既有利于代謝產物的大量累積，又不會影響微生物自身的生長代謝。但發酵溫度過高，易造成雜菌的感染而影響發酵。

2.5.4 硫酸銨的添加量對產蛋白質的影響

微生物生長需要營養物質，主要的有碳源、氮源、無機鹽、水分等。從實驗來看，酵母菌以木霉、曲霉等一次發酵產生的還原糖類作為碳源，能滿足酵母及枯草芽孢桿菌的孢子的萌發、菌絲的生長及發酵的需要，而氮原明顯不足，因此添加的硫酸銨氮源對發酵具有顯著的影響。

3 結 論

在以黑曲霉和木霉雙菌一次發酵的啤酒糟中，添加啤酒酵母與枯草芽孢桿菌進行二次混菌發酵，并利用響應面進行發酵條件分析優化，結果表明：啤酒酵母和枯草芽孢桿菌二次發酵啤酒糟對應的最佳條件為溫度35 ℃，接種量16.26 %，酵母菌和枯草芽孢桿菌接種量比為5∶1，添加硫酸銨3.46 %，尿素添加量2 %，發酵時間4 d，理論粗蛋白質含量38.11 %，表明通過二次混菌發酵能顯著提高啤酒糟粗蛋白含量。

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(編校 陳志陽)

On Optimization of Second Fermentation of Brewer's Grains Through Response Surface Based onBeerYeast

BINDong-mei1,HUANGHe-qing-tao2,YANGCan1,YICheng1,WUDu-qing3,RAOLi-qun2

(1.College of Life Science and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang Hunan 421008,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha Hunan 410128,China;3.Yanjing(Hengyang) Beer Co.Ltd,Hengyang Hunan 421008,China)

In order to improve the output with high protein in Brewer's Grains with fermentation,take the Brewer's Grains as raw materials which through first fermentation withAspergillusandTrichoderma,the crude protein content as the index,secondary fermentation with mixedBacillussubtilisandBeerYeast,and optimized the craftwork with response surface analysis.Results show that: the secondary fermentation withbeeryeastandBacillussubtilisin optimum conditions which temperature was 35 ℃,inoculum was 16.26 %,beeryeastandBacillussubtilisinoculation ratio was 5:1,ammonium sulfate was 3.46 %,urea content was 2 %,fermentation time was 4 days,the theory crude protein content was 38.11 %.

brewer's grains; mixed microorganism; secondary fermentation; response surface analysis; high protein

2016-10-09

湖南省自然科學基金省市聯合基金(14JJ5001)

賓冬梅(1970-)，教授，碩士生導師，研究方向：農副產品開發與利用。

Q936

A

1673-0313(2016)06-0101-05