豬精液冷凍保存影響因素研究進展

張 亮，姜 垠，邱進杰，曾 渝（.重慶市六九原種豬場有限公司，重慶 409000；2.重慶市畜牧科學院，重慶 402460）

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豬精液冷凍保存影響因素研究進展

張 亮1，姜 垠1，邱進杰2*，曾 渝1
（1.重慶市六九原種豬場有限公司，重慶 409000；2.重慶市畜牧科學院，重慶 402460）

摘 要：由于豬凍精在經濟生產中具有重要意義，其關鍵技術——豬精液冷凍保存技術已成為研究的熱點。本文對豬精液冷凍原理及冷凍損傷進行了說明，并對精液稀釋前處理、稀釋液及添加劑、冷凍保護劑、冷凍程序與解凍、冷凍劑型等方面的研究進展進行了綜述。

關鍵詞：豬；精液；冷凍保存；影響因素

豬人工授精技術已經廣泛應用于畜牧業生產，所用精液多為鮮精，與凍精相比，用鮮精配種存在精液保存時間短，活力受運輸環境影響大、浪費嚴重和易交叉感染等問題，使人們的視線逐漸轉移到冷凍精液上[1]。豬精液冷凍技術始于20世紀50年代，是指利用干冰、液氮、液氦等作冷源，將豬精液經特殊處理后冷凍，保存在超低溫狀態下，以達到長期保存的目的。冷凍保存打破了豬精液使用的時空界限，必將加快養豬業的發展，對畜牧業可持續發展和繁榮具有重要作用。豬精子本身對冷應激特別敏感，在冷凍過程中極易損傷，從而造成與配母豬的受胎率低、窩產仔數少等問題，嚴重制約豬冷凍精液的應用與推廣。因此，深入系統地研究豬精液冷凍保存關鍵技術，探討影響豬冷凍精液保存影響因素，進一步提高豬冷凍精液質量，已成為國內外養豬生產中急待解決的問題。本文將就豬精液冷凍保存影響因素研究進展進行綜述。

1　?豬精液冷凍原理及冷凍損傷

豬精液冷凍技術是指利用干冰(-79℃)、液氮(-196℃)、液氦(-269℃)等作為冷源，將精液進行特殊處理后冷凍，然后保存于超低溫狀態，使精子細胞的代謝接近完全停止，使精子在生命靜止狀態下保存下來，達到長期保存的目的，當溫度升高后又能恢復活性，且具備受精的能力。

在冷凍過程中，精子細胞會受到冰晶化導致的溶液效應所致損傷(化學性損傷)和冰晶對細胞膜及細胞內部結構產生機械性損害(物理性損傷)[2]。損傷的程度一般由“冷凍—解凍”速率和“冷凍—解凍”溫度決定。然而，細胞內形成冰晶是不可避免的，控制所形成冰晶的大小和數量，減少或不形成能夠對精子造成物理性損傷的大冰晶，而僅維持在微晶狀態，就會減少對精子的損傷。為減少對精子細胞的損傷，學者們進行了大量的研究，并取得了重大的進展。

2　?豬精液冷凍保存的影響因素

2.1稀釋前處理

公豬精子在迅速冷卻時會失去活力，這種現象發生在精液采集后迅速冷卻至15℃、5℃或0℃時，稱之為“冷休克”[3]。在所有家畜中，公豬的精子對冷休克最敏感，但精子在室溫下用低的稀釋倍數稀釋，然后緩慢降溫或孵育l～5 h后能增強抗凍能力，故大部分精液冷凍程序均包括一個15℃或15℃以上的數小時的冷凍平衡時間。此外，在去除精清的操作上，Carvajal等[4]研究發現高轉速短時間離心不會影響精子的恢復和頂體的完整率，因此建議利用高轉速短時間離心去除精清。李玉芳等[5]研究結果顯示，精清不能完全去除，精清保留量為0 mL/10 mL時解凍精子的存活率和活力要顯著低于0.5 mL/10 mL和1 mL/10mL。

2.2稀釋液及添加劑

在溫度變化過程中，精液對精子的保護能力是有限的。為此，進行精液冷凍保存就要配合使用專用的溶液先將精液進行稀釋。對稀釋液的基本要求包括pH、緩沖性、滲透壓和低溫保護性能。一般的稀釋劑都由糖類、蛋白質、脂類及其他添加物組成。

徐振軍等[6]進行了不同組合的糖類對精子冷凍保存的影響試驗，研究結果顯示，以葡萄糖-乳糖為基礎液組的精子存活率極顯著高于以葡萄糖-蔗糖-檸檬酸鈉組和葡萄糖-乳糖-檸檬酸鈉組，且解凍后精子頂體完整率顯著高于另外2組。金一等[7]發現海藻糖對精子冷凍保存是有益的，且能抑制精子內活性氧的發生。胡建宏等[8]發現添加25%的海藻糖可以明顯抑制精子獲能，且海藻糖只有與甘油共同作用時才能在“冷凍—解凍”過程更加有效地保護精子。此外，有研究表明，在稀釋液中添加10 mg/L維生素C 、0.05%可溶性N-乙酰基-D-葡糖胺、類透明質酸、安鈉咖、海膽色素、2-丙羥基-β-環式糊精等可提高解凍后精子頂體完整率和質膜完整性，保護精子活力。

為提高豬精液的冷凍效果，許多學者對豬精液的冷凍稀釋液及其添加劑進行了大量的探索實驗，但是效果一直都不是很理想，還沒有找到一個穩定可靠的稀釋液及其添加劑配方，有待進一步研究。

2.3冷凍保護劑

冷凍保護劑是指在溶液中可同水分子結合，發生水合作用，弱化水的結晶過程，使溶液的黏性增加，從而減少冰晶的形成；同時冷凍保護劑可以通過在細胞內外維持一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質的損傷[9]。在精液冷凍保存過程中，冷凍保護劑對精子的冷凍效果及解凍后精子質量至關重要。

甘油是目前應用較廣泛的一種冷凍保護劑，對精子既有保護作用，又有毒害作用。針對添加不同終濃度的甘油對精子活力影響的研究較多，大多結果顯示在添加2%～4%時，其解凍后精子活力和頂體完整率較高[10]。但也有研究顯示，添加14%的甘油后液氮冷凍，39℃水浴解凍后，豬精子活力仍能達到48%[11]。目前國內外研究者多數使用的是低濃度甘油( < 4% )，而3%甘油是最常用的濃度標準。劉宏等[12]研究比較了不同平衡時間和不同DMF添加量對豬精液冷凍保護效果的影響，研究結果表明，DMF能完全替代甘油，獲得較好的冷凍保護效果。此外，針對乙二醇、丙二醇、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基亞砜(DMSO)等冷凍保護劑的研究也較多[13]。

2.4冷凍程序與解凍

豬精液冷凍的冷源主要以液氮為主，從精液的采集至最終保存，其溫度變化范圍在230℃左右，在冷凍過程中，溫度的變化對精子的影響比較大，主要表現為，解凍后精子活力喪失，精子膜的選擇通透性降低、頂體膜損傷等。精液“冷凍—解凍”時，使精子快速越過－5～-25℃這一高危險溫區是提高精子冷凍后存活率和品質的一個重要手段[14]。

冷凍速率對豬精液的冷凍至關重要，在冷凍精液制作過程中必須提高冷凍速度，溫度須持續下降，不能出現回升現象。精液在冷凍過程中應快速通過危險溫區(0～－60℃)，這樣才能提高凍精解凍后的活率。以15℃為分界線，先將精液在室溫(22℃)下等溫稀釋并在1 h內降溫至15℃，維持3～4h后再利用l h時間從15℃緩慢降溫至5℃并平衡2 h，然后用含冷凍保護劑的第二液等溫稀釋并分裝冷凍，這樣可將精子的冷休克損傷降為最低。

解凍同冷凍一樣重要，目前常用的解凍液有Glucose-EDTA解凍液與DPBS-BSA解凍液。同時，適當的解凍溫度能使冷凍精子快速越過危險溫區，使玻璃化快速越過結晶態直接變為液態，降低對精子的傷害。Watson[15]認為精液解凍溫度與動物品種及精子對“冷凍—解凍”溫度驟變的敏感性有關，但多數學者傾向于采用37℃解凍。鄭筱峰等[16]研究表明，37℃水浴30s解凍法優于室溫20 s后再于37℃水浴10s解凍法，前者的精子運動度、質膜完整率、頂體完整率和體外受精胚胎發育率均顯著高于后者，且前者在體外授精胚胎發育率方面與新鮮精液對照組無統計學差異。Marta等[17]研究結果顯示，甘油濃度和解凍速率均顯著影響解凍后精子的所測質量參數(P< 0.05)；3%的甘油或者解凍速率為l 800℃/min時解凍后的精子質量最高(P < 0.05)，經2×2因子設計分析結果表明，二者的組合效應所得的解凍后精子質量亦最高。

目前研究證明，經37℃、30s水浴解凍方法更適合0.25mL細管豬凍精的解凍；而顆粒凍精解凍適用干解法：40～45℃、8～10s即可使精子的平均活率達到最高。

2.5冷凍劑型

精液冷凍保存的形式有主要有：安瓿、顆粒、鋁箔(塑料)袋和細(麥)管法。細管法是新近發展出來的冷凍方法，采用細管法便于保存，也有助于提高精液的利用率，包括5 mL大管、0.5 mL細管和0.25 mL細管。所有這些保存類型既有其優點，亦有其缺點。

顆粒和0.25 mL、0.5 mL小型細管擁有較大的表面積容量比使其更適合低溫冷凍保存，然而顆粒法的冷凍精液在來源及頭份的區別上存在困難，不易解凍且容易造成交叉污染；細管法冷凍的豬精液解凍后精子存活率略低于顆粒法，受胎率卻比顆粒法高，但是1頭份一般需要解凍10～20根小型細管或2～3根扁平細管，這成為推廣應用的主要障礙；5 mL的大型細管具有1頭份的精子數量，但其表面積容量比小，難以實現理想的冷凍和解凍過程[18]。塑料袋包裝的試驗結果表明，它可以均勻地冷凍和解凍，解凍后精子存活率也高，并含有l頭份精子數量，單個扁平袋子和多重扁平袋子(分別為54%和49% )中冷凍的精子質膜完整率顯著地高于0.5 mL塑料細管(38% )中冷凍的精子(P< 0.05)，解凍后多重扁平袋子比0.5 mL塑料細管每劑量中存在更多活精子，但其面積太大，不適合放置在液氮罐里保存，因此尚未應用于商業生產[19]。

由于公豬射精液量較大，一般0.25 mL、0.5 mL麥管很難滿足要求。通過努力，近年來5 mL大管冷凍豬精液也獲得成功，為進一步進行豬冷凍精液應用奠定了基礎。塑料細管的大小和質地對精液的保存也十分重要，要求管徑細、壁薄，便于傳熱，適于快速冷凍。容量最好是一次授精的劑量，精子密度大可用容量小些的細管。

3　存在的問題及展望

半個世紀以來，研究人員對豬精液冷凍技術進行了大量研究，包括稀釋前的處理、稀釋液的組成和添加劑、冷凍保護劑及濃度、降溫速率和降溫條件、解凍液組成及解凍程序等。盡管隨著冷凍稀釋液及保護劑配方的改進和研發，豬冷凍精液在各方面的質量都有所提高，但其實際使用效果與鮮精仍有很大的差距，主要表現在以凍精進行人工授精得不到與液態鮮精相當的產仔數而難以推廣應用。究其原因，主要有：在理論上，豬精液冷凍過程中的“冷凍—解凍”機理、精子損傷機理、在“冷凍—解凍”過程中外部環境變化對精子的影響、精子內部組成物質的變化規律及分子機制等諸多方面尚不完全清楚；在實際操作中，“冷凍—解凍”程序和稀釋液、解凍液的組成不一致，甚至差別較大；在生產上，存在著輸精劑量和方法不同、操作程序相對復雜等原因[1]。

隨著分子生物學技術的發展，從分子生物學層面探索冷凍損傷的原理以及溫度、滲透壓、氧化應激反應等對精子頂體、質膜及DNA損傷的機制，探究精液冷凍過程中各個階段精子細胞內外的變化成為了可能。相信不久的將來，隨著對影響精子冷凍相關因素的深入研究，一定能夠攻克豬精液冷凍保存中存在的技術難題。

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(收稿日期：2015-08-31)

*通訊作者：邱進杰，E-mail：429482286@qq.com

作者簡介：張亮（1990-），男，重慶開縣人，碩士，E-mail：zhangliang215@163.com