肝臟X受體α對高糖所致心肌細胞凋亡的影響及其機制

成永霞，孫立新，張大偉，徐彪，郭素芬，劉貴波( 牡丹江醫學院，黑龍江牡丹江570;牡丹江醫學院附屬紅旗醫院)

肝臟X受體α對高糖所致心肌細胞凋亡的影響及其機制

成永霞1，孫立新1，張大偉1，徐彪2，郭素芬1，劉貴波1
( 1牡丹江醫學院，黑龍江牡丹江157011;2牡丹江醫學院附屬紅旗醫院)

摘要:目的觀察肝臟X受體α( LXRα)對高糖所致心肌細胞凋亡的影響，并探討其機制。方法將對數生長期的H9c2大鼠心肌細胞隨機分為5組，空白組、低T0組、中T0組、高T0組分別用二甲基亞砜及5、10、20 μmol/L 的LXRα激動劑T0901317預處理12 h，高糖對照組不處理;之后低T0組、中T0組、高T0組、高糖對照組用33 mmol/L的高糖浸潤24 h。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blotting法檢測細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達量。結果空白組、低T0組、中T0組、高T0組、高糖對照組細胞凋亡率分別為10.67%±0.82%、29.53%±4.21%、19.76%±2.80%、15.15%±1.90%、34.09%±5.32%;多組間比較，P＜0.05;低T0組、高糖對照組與空白組比較，P均＜0.01;中T0組、高T0組與高糖對照組比較，P均＜0.05。與空白組比較，低T0組、中T0組、高T0組、高糖對照組Bcl-2表達均降低，Bax和Caspase-3表達均增加，P均＜0.05;與中T0組、高T0組比較，高糖對照組上述指標變化更明顯，P均＜0.05;低T0組與高糖對照組上述指標比較，P均＞0.05。結論中、高濃度LXRα可抑制高糖所致的心肌細胞凋亡，其機制可能與降低Bax、Caspase-3表達和增加Bcl-2表達有關。

關鍵詞:心肌細胞; T0901317;肝臟X受體;高血糖;細胞凋亡

糖尿病性心肌病是糖尿病的嚴重并發癥［1，2］，高血糖是其獨立危險因素［3，4］。肝臟X受體( LXRs)包括α和β兩個亞型，是由配體激活的轉錄因子，屬于核激素受體超家族［5～9］。近期研究發現，LXRs是人體中潛在的藥理學靶受體，人工合成的LXRs激動劑被用于多種人類疾病的治療［10，11］。T0901317(以下稱T0)是一種人工合成的強效LXRα激動劑，已被證實可提高肥胖小鼠的胰島素敏感性［12］，并改善2型糖尿病患者的病情［13］，可能與其抑制磷酸腺苷活化蛋白激酶釋放而減弱高糖所致的內皮干細胞功能障礙有關［14］;但被T0激活的LXRα是否可以阻止高糖所致的心肌細胞凋亡尚未證實。2014年1～12月，我們對上述問題進行了研究，現分析結果并探討其機制。

1　材料與方法

1.1材料H9c2大鼠心肌細胞由美國模式培養物保藏所提供; T0購自Cayman公司;細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司; Caspase-3一抗、Bax一抗、Bcl-2一抗均購自美國Sigma公司。

1.2細胞分組與處理H9c2細胞用杜氏培養液(包括5.5 mmol/L葡萄糖、10% FBS、100 U/mL盤尼西林和100 mg/mL鏈霉素)培養。將對數生長期的細胞隨機分為5組，接種于24孔板，每孔做3個復孔，在孵育箱中于37℃、5% CO2條件下培養其中，空白組、低T0組、中T0組、高T0組分別用二甲基亞砜及5、10、20 μmol/L的T0預處理12 h，高糖對照組不處理，之后低T0組、中T0組、高T0組高糖對照組加入33 mmol/L的高糖(稱取0.8 g葡萄糖溶解在200 mL含有10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM低糖培養基中)浸潤24 h。

1.3相關指標觀察

1.3.1細胞凋亡率采用流式細胞儀。高糖浸潤24 h后收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min;吸除上清，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞。依次加入5 μL Annexin V-FITC、Propidium Iodide混勻，室溫避光孵育15 min。上流式細胞儀，檢測細胞凋亡率。

1.3.2細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達采用Western blotting法。抽提蛋白質并定量，SDS PAGE電泳，轉印，封閉，孵育一抗、二抗，ECL底物發光;抗體剝脫，封閉，孵育內參抗體及其二抗，ECL底物發光。將膠片進行掃描，用Gel-Pro-Analyzer軟

件分析，目標蛋白表達量以目標條帶光密度與β-actin光密度的比值表示。

1.4統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組細胞凋亡率比較空白組、低T0組、中T0組、高T0組、高糖對照組細胞凋亡率分別為10.67%± 0.82%、29.53%±4.21%、19.76%±2.80%、15.15%± 1.90%、34.09%±5.32%;多組間比較，P＜0.05;低T0組、高糖對照組與空白組比較，P均＜0.01;中T0組、高T0組與高糖對照組比較，P均＜0.05。

2.2各組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達比較見表1。

表1　各組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達比較(相對表達量，珔x±s)

3　討論

LXRα可以通過與靶基因啟動子區域的LXR反應原件相結合而調節靶基因的轉錄，LXRα及其下游調控網絡可能涉及了糖尿病心肌病的發生、發展。我們前期研究發現，糖尿病心肌病大鼠LXRα基因啟動子區的甲基化顯著，進一步證明了LXRα與糖尿病心肌病的發病有關［15］。

T0是一種強選擇性LXRα激動劑，可增加血清LXRα水平［12］。本研究對心肌細胞進行T0預處理，觀察LXRα對高血糖所致心肌細胞凋亡的影響。結果發現，高糖對照組細胞凋亡率顯著高于空白組，說明高糖可以導致細胞凋亡率增加;中T0組、高T0組細胞凋亡率明顯低于高糖對照組，而低T0組細胞凋亡率與高糖對照組比較無統計學差異，說明10、20 μmol/L的T0可有效抵抗高糖所致的心肌細胞凋亡，而5 μmol/L的T0則沒有這種作用，可能是5 μmol/L的T0濃度太低，作用不明顯。

Bcl-2/Bax蛋白家族是線粒體細胞色素C釋放的調節蛋白。Bcl-2是抗凋亡蛋白，可阻止細胞色素C的釋放，維持線粒體膜對蛋白質的不通透性; Bax則能夠誘導細胞色素C的釋放，加速細胞凋亡。本研究中，單獨經高糖處理的心肌細胞Caspase-3、Bax表達增加，Bcl-2表達減少;而經10、20 μmol/L的T0預處理后的心肌細胞Bax、Caspase-3表達降低，Bcl 2表達增加，5 μmol/L的T0則沒有這種作用。因此，被中、高濃度T0激活的LXRα可抑制高糖所致的心肌細胞凋亡，該作用與其降低Bax、Caspase-3表達和增加Bcl-2表達有關，提示T0具有防治糖尿病性心肌病的潛在藥理學作用。

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收稿日期:( 2015-02-28)

通信作者:劉貴波，E-mail: lgb20073@163.com

基金項目:牡丹江醫學院科學技術研究項目( ZS201311)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0028-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R36

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.010