熱量限制對大鼠血清支鏈氨基酸、芳香族氨基酸、甘氨酸水平的影響及意義

宮環，楊睿悅，韓怡文，孫亮，崔菊，張延，張恩毅，張鐵梅(北京醫院老年醫學研究所，衛生部北京老年醫學研究所，北京100730)

熱量限制對大鼠血清支鏈氨基酸、芳香族氨基酸、甘氨酸水平的影響及意義

宮環，楊睿悅，韓怡文，孫亮，崔菊，張延，張恩毅，張鐵梅
(北京醫院老年醫學研究所，衛生部北京老年醫學研究所，北京100730)

摘要:目的觀察熱量限制( CR)對大鼠血清支鏈氨基酸［纈氨酸( Val)、異亮氨酸( Ile)、亮氨酸( Leu)］、芳香族氨基酸［酪氨酸( Tyr)、苯丙氨酸( Phe)］及甘氨酸( Gly)水平的影響，并探討其與胰島素敏感性的關系。方法將20只雄性SD大鼠隨機分為觀察組和對照組各10只，對照組給予自由飲食，觀察組限制熱量攝入為對照組的60%。喂飼12周后稱取兩組體質量及附睪旁脂肪墊質量;行胰島素耐量試驗，繪制血糖值曲線并計算曲線下面積。采用液相色譜串聯質譜法檢測兩組血清Val、Ile、Leu、Tyr、Phe及Gly。結果觀察組體質量、附睪旁脂肪墊質量均低于對照組，P均＜0.01。觀察組血糖值曲線下面積為728.1±65.7，對照組為955.1±39.0，P＜0.01。觀察組血清Ile、Leu、Tyr水平均低于對照組，Gly水平高于對照組，P均＜0.05。兩組血清Val、Phe水平比較，P均＞0.05。結論CR可能通過升高大鼠血清Gly水平，降低Ile、Leu、Tyr水平而提高其胰島素敏感性。

關鍵詞:熱量限制;胰島素敏感性;支鏈氨基酸;芳香族氨基酸;甘氨酸;大鼠

Effects of caloric restriction on levels of serum branched chain amino acids，aromatic amino acids and glycine of rats

GONG Huan，YANG Rui-yue，HAN Yi-wen，SUN Liang，CUI Ju，ZHANG Yan，ZHANG En-yi，ZHANG Tie-mei
( Beijing Hospital and Beijing Institute of Geriatrics，Ministry of Health，Beijing 100730，China)

Abstract:Objective To observe the effects of caloric restriction ( CR) on levels of serum branched chain amino acids［valine ( Val)，isoleucine ( Ile)，leucine ( Leu)］，aromatic amino acids［tyrosine ( Tyr) and phenylalanine ( Phe)］and glycine of rats，and to investigate their relationships with insulin sensitivity.Methods Twenty male SD rats were randomly divided into the control group which was fed ad libitum and the observation group which was fed 60% of the food as in the control group.After 12 weeks，body weight was measured and insulin tolerance test ( ITT) was performed.Blood glucose value curve was drawn and wevcalculated the area under the curve ( AUC).The levels of Val，Ile，Leu，Tyr，Phe and Gly were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Results Both body weight and epididymal fat pad weight were lower in the observation group than in the control group ( all P＜0.01).AUC of blood glucose in the observation group was 728.1±65.7，and 955.1±39.0 in the control group，respectively ( P＜0.01).The serum concentrations of Ile，Leu and Tyr in the observation group were lower than those of the control group，and the concentration of Gly was higher ( all P＜0.05).No significant difference was found in the serum levels of Val and Phe between the two groups ( all P＞0.05).Conclusion CR increases the serum level of Gly，reduces the levels of Ile，Leu and Tyr，and thus it increases the insulin sensitivity.

Key words:caloric restriction; insulin sensitivity; branched chain amino acids; aromatic amino acids; glycine; rats

研究發現，血液中支鏈氨基酸( BCAAs)水平與肥胖、胰島素抵抗或2型糖尿病的發病密切相關［1～3］;芳香族氨基酸( AAAs)和甘氨酸( Gly)等均為與代謝綜合征有關的代謝因子［3］。近年來以胰島素抵抗為特征的代謝綜合征發病率逐年上升，熱量限制( CR)是被證實可以預防其發生、發展的有效

手段［4，5］。2014年5～9月，我們觀察了SD大鼠CR后血清BCAAs、AAAs及Gly水平的變化，并探討其與胰島素敏感性的關系，以期為代謝綜合征的預防和治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料雄性8周齡SD大鼠20只，體質量242 ～282 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限責任公司。纈氨酸( Val)、異亮氨酸( Ile)、亮氨酸( Leu)、酪氨酸( Tyr)、苯丙氨酸( Phe)及Gly標準品、色譜純甲酸均購自美國Sigma-Aldrich公司，同位素內標物( Val-D8、Ile-D10、Leu-D3、Tyr-D4、Phe-D5和Gly-D5)均購自Cambridge同位素實驗室，色譜純乙腈購自美國Fisher公司。1200型高效液相色譜儀購自美國Agilent公司，API 4000 Triple Quadruple質譜儀購自美國AB SCIEX公司。

1.2實驗動物分組與處理將20只SD大鼠按照隨機數字表法分為觀察組和對照組，各10只。兩組均于清潔級環境下飼養，室內光照12 h晝夜循環，室溫22～25℃;對照組自由飲食，觀察組限制熱量攝入為對照組的60%，共喂飼12周。

1.3相關指標觀察

1.3.1體質量及附睪旁脂肪墊質量兩組過夜禁食12 h后，稱取體質量。用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，分離附睪旁脂肪墊并稱其質量。

1.3.2胰島素耐量兩組禁食5 h后，腹腔注射胰島素0.5 IU/kg，分別于注射即刻及注射后15、30、60、120 min取尾血，采用強生血糖儀及配套試紙條測定血糖值。采用GraphPad Prism 5.01軟件繪制血糖值曲線，并計算曲線下面積( AUC)。

1.3.3血清氨基酸水平采用液相色譜串聯質譜法。收集兩組腹主動脈血，離心后取血清，－80℃保存。分別取0.05 mL標準系列溶液和血清樣品，加入內標混合溶液0.05 mL、0.1%甲酸乙腈溶液0.4 mL震蕩離心。吸取上清液0.05 mL于入樣瓶中，室溫下氮氣吹干，加入0.1%甲酸水溶液0.2 mL，復溶后上機。采用Waters Shield C18色譜柱( 3.5 μm，2.1× 150 mm)，流動相為10%乙腈、含0.01%甲酸水溶液流速0.3 mL/min，柱溫20℃。串聯質譜采用正離子電噴霧離子化的多離子反應監測模式，霧化氣、加熱氣、氣簾氣和碰撞氣分別為620.5、482.7、517.3和13.8 kPa，噴霧電壓5 500 V，去溶劑溫度700℃。以標準溶液氨基酸水平為X軸，氨基酸和相應內標峰面積的比值為Y軸，進行線性回歸分析，將樣品峰面積比代入標準曲線方程，參照Yang等［6］的方法計算血清Val、Ile、Leu、Tyr、Phe及Gly水平。

1.4統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組體質量、附睪旁脂肪墊質量比較見表1。

表1　兩組體質量、附睪旁脂肪墊質量比較( g，珔x±s)

2.2兩組胰島素敏感性比較兩組各時點血糖水平比較見表2。觀察組AUC為728.1±65.7，對照組為955.1±39.0;兩組比較，P＜0.01。

表2　兩組各時點血糖水平比較( mmol/L，珔x±s)

2.3兩組血清氨基酸水平比較見表3。

表3　兩組血清氨基酸水平比較( mg/L，珔x±s)

3　討論

隨著社會人口的老齡化和生活方式的改變，以胰島素抵抗為特征的代謝綜合征發病率逐年上升［7］。CR可以通過調節胰島素信號通路、提高胰島素敏感性等途徑預防、延緩和減輕代謝綜合征等衰老或肥胖相關疾病的發生、發展，但其機制仍未明了［7，8］。本研究結果顯示，觀察組體質量、附睪旁脂肪墊質量均顯著低于對照組，表明CR模型建立成功。胰島素耐量試驗可間接反映胰島素的敏感性［9］。本研究結果顯示，觀察組胰島素耐量試驗中胰島素負荷120 min的血糖值及AUC均顯著低于對照組;提示CR可顯著提高大鼠的胰島素敏感性同時也進一步證實本研究中CR模型建立成功。

早在1969年就有研究發現，肥胖、胰島素抵抗

或2型糖尿病患者血液中BCAAs、AAAs等氨基酸水平升高［10］。Wang等［11］發現，血液中Phe和Tyr水平升高會使2型糖尿病的發病風險上升5倍。一系列研究表明，BCAAs、AAAs及其代謝產物與胰島素抵抗及冠心病發病密切相關，且其相關性高于血清脂肪酸［1，12，13］。Xiao等［14］給小鼠喂飼Leu缺陷飼料，發現其胰島素敏感性升高。本研究也顯示，觀察組血清Ile、Leu、Tyr水平均顯著低于對照組。以上結果提示，血清Ile、Leu、Tyr水平降低可能與CR可提高胰島素敏感性有關。此外，Hsiao等［15］用降糖效果不同的幾種噻唑烷二酮類藥物處理Zucker肥胖大鼠，發現其控制血糖效果與BCAAs分解代謝通路酶編碼基因的調節能力增強相關。因此推測，CR可能調節了上述氨基酸代謝通路中的酶，從而改變這些氨基酸的水平。

與上述幾種氨基酸相反，血液Gly水平在消瘦人群中高于超重及肥胖人群，代謝正常的健康人群高于代謝異常患者，說明血液中Gly水平升高表示個體處于健康狀態，即Gly是保護性因素［3］。本研究觀察組血清Gly水平顯著高于對照組，提示CR可升高大鼠血清Gly水平，從而改善其代謝狀態。

綜上所述，CR可改變大鼠血清氨基酸譜的表達，而提高其胰島素敏感性。本研究為代謝綜合征患者的飲食干預治療提供了理論依據。

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收稿日期:( 2015-04-09)

通信作者簡介:張鐵梅( 1953-)，女，博士、研究員，研究方向為生活方式干預的作用及機制。E-mail: tmzhang126@126.com

作者簡介:第一宮環( 1977-)，女，博士、助理研究員，研究方向為熱量限制的作用及機制。E-mail: huan0220@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81300693) ;國家十二五科技支撐計劃項目( 2012BAI10B01)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0011-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R587.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.004