卵巢癌患者腫瘤浸潤淋巴細胞的抗腫瘤活性觀察

馬丹宇，張維維，劉國炳，鄧歡，梁衛(wèi)江( 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣州5055;南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院)

卵巢癌患者腫瘤浸潤淋巴細胞的抗腫瘤活性觀察

馬丹宇1，張維維1，劉國炳1，鄧歡2，梁衛(wèi)江1
( 1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣州510515;2南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院)

摘要:目的觀察卵巢癌( OC)患者腫瘤浸潤淋巴細胞( TILs)的抗腫瘤活性。方法采用聯(lián)合酶消化分離并提純OC組織中的TILs和OC細胞，以IL-2體外誘導活化擴增TILs。活化前及活化第14天，采用流式細胞儀檢測TILs免疫表型() ;活化前及活化第3、7、14天，采用MTT法檢測TILs對自體OC細胞、人白血病細胞株K562、人B細胞淋巴瘤細胞株Raji的殺傷活力;收集經(jīng)活化第14天TILs作用前后的OC細胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測腫瘤分子標志物CA-125、CA-153、血管內(nèi)皮生長因子( VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9( MMP-9)。結(jié)果與活化前比較，活化第14天TILs中細胞比例增加細胞比值降低;隨著活化時間延長，TILs對三種靶細胞的殺傷率增高( P均＜0.05)，且對OC細胞的殺傷率高于其余2種細胞( P均＜0.05) ;與處理前相比較，活化第14天TILs作用的OC細胞培養(yǎng)上清液中CA-125、VEGF、MMP-9水平均顯著降低( P均＜0.05)。結(jié)論卵巢癌患者的TILs具有抗腫瘤活性，低濃度IL-2可增強其特異性和非特異性抗瘤活性。

關(guān)鍵詞:卵巢癌;腫瘤浸潤淋巴細胞;免疫表型;血管內(nèi)皮生長因子;基質(zhì)金屬蛋白酶

Antitumor activity of tumor-infiltrating lymphocytes in patients with ovarian cancer

MA Dan-yu1，ZHANG Wei-wei，LIU Guo-bing，DENG Huan，LIANG Wei-jiang
( 1Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)

Abstract:Objective To observe the antitumor effect of tumor-infiltrating lymphocytes ( TILs) in patients with ovarian cancer ( OC).Methods The TILs and autologous OC cells were isolated and purified from OC tissues by using joint enzyme digestion method，then the TILs were activated and amplified in vitro by IL-2.The immunophenotypes (，) of TILs were tested by flow cytometry before the activation and the 14th day of activation; the Methyl Thiazolyl Tetrazolium ( MTT) was used to detect the cytotoxic effects of the TILs on autologous OC cells，human leukemia cell line K562 and human B lymphoma cell line Raji before activation and on the 3th，7th and 14th day of activation; the culture supernatant of ovarian cancer was collected before and after the autologous OC cells were killed by TILs on 14th day，then，the tumor molecular markers CA-125，CA-153，vascular endothelial growth factor ( VEGF) and matrix metalloproteinase 9 ( MMP-9) of culture supernatant were detected by using the enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA).Results Compared with before activation，the proportions oof TILs were significant increased on the 14th day of activation，while theratio was significant decreased.With the prolonged activation time，the cytotoxic effects of TILs on the three kinds of target cells were significantly increased ( all P＜0.05)，and the killing rate of OC cells was higher than the rest of two kinds of cells ( all P＜0.05).Compared with before treatment，the CA-125，VEGF and MMP-9 of autologous OC in the culture supernatant were significantly decreased on the 14th day of activation ( all P＜0.05).Conclusion The TILs from OC tissues have antitumor activity，and the specificity and non-specificity cytotoxic function of TILs can be effectively activated and amplified by low concentration of IL-2.

Key words:ovarian carcinoma; tumor-infiltrating lymphocytes; immunophenotype; carbohydrate antigen; vascular endothelial growth factor;matrix metalloproteinase

卵巢癌( OC)發(fā)病隱匿、腫瘤異質(zhì)性高、轉(zhuǎn)移率高，是女性生殖道惡性腫瘤的主要死亡原因［1］。目前，免疫治療已成為除手術(shù)、化療、放療外的一種有效治療方法。腫瘤浸潤淋巴細胞( TILs)是從腫瘤組織中分離的一群富含腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞的致敏淋巴細胞群體，對自體和異體腫瘤細胞均具有較強的殺傷活性，其抗腫瘤活性比淋巴因子激活的殺傷細胞高50～100倍［2］。研究發(fā)現(xiàn)，TILs治療惡性黑色素瘤、腎癌等均療效顯著［3～8］，但TILs 在OC治療中的作用尚處于初期研究階段。為此，我們于2012年4月～2013年3月對OC患者的TILs進行分離、活化，觀察其抗腫瘤活性。

1　材料與方法

1.1材料收集同期于南方醫(yī)院行腫瘤細胞減滅術(shù)治療的初治OC患者的OC組織標本12例份，患者年齡38～65歲，均術(shù)后病理學檢查確診;人白血病細胞株K562、人B細胞淋巴瘤細胞株Raji，均由南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液科實驗室提供;人淋巴細胞分離液( 100% Ficoll-Hypaque)購自天津市灝洋生物制品有限公司;Ⅱ型膠原酶購自Invitrogen公司;透明質(zhì)酸酶和DNA酶購自Sigma公司;白細胞介素-2( IL-2)購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司;熒光標記單克隆抗體購自美國BD公司; ELISA試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。

1.2自體OC細胞與TILs獲取將OC組織標本剪碎，采用聯(lián)合消化法［9，10］分離獲得自體OC細胞及TILs。

1.3細胞培養(yǎng)與TILs活化K562、Raji細胞均使用10%FBS RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況換液、傳代培養(yǎng);自體OC細胞及TILs分別用含20%和10%胎牛血清( FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。在TILs培養(yǎng)液中加入2 500 U/mL 的IL-2，使TILs活化、擴增，每1～2 d補充IL-2 1次，共活化14 d。

1.4 TILs活化前后免疫表型觀察活化前、活化第14天時，采用流式細胞術(shù)檢測TILs免疫表型，包括T淋巴細胞。

1.5 TILs對腫瘤細胞的殺傷作用觀察分別取細胞密度為1×105/mL的3種細胞80 μL接種于96孔板中，每組設(shè)置3個復孔，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取活化前及活化第3、7、14天的TILs細胞，按照效靶比( E∶T) 50∶1分別與3種細胞共培養(yǎng)12 h。采用MTT法測定各孔570 nm處的光密度OD值，計算TILs對腫瘤細胞的殺傷率。殺傷率=［1－( ODE + T－ODE)/ODT］，其中ODE + T為TILs混合靶細胞的OD值，ODT為單純靶細胞孔處OD值。

1.6 TILs作用前后OC細胞上清液腫瘤分子標志物檢測收集活化前及活化第14天TILs作用的OC細胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測腫瘤分子標志物CA-125、CA-153、血管內(nèi)皮生長因子( VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9( MMP-9)。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，采用單因素方差分析、獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1 TILs活化前后免疫表型變化見表1。

表1　 TILs活化前后免疫表型變化( n =12，±s)

表1　 TILs活化前后免疫表型變化( n =12，±s)

注:與活化前比較，*P＜0.01。

活化時間　CD+3( %)　 CD+4( %)　 CD+8( %)　 CD+4/CD+8活化前48.2±14.5　 20.4±16.7　 21.7±11.9　 1.5±1.7活化第14天　69.6±10.7*25.6±16.0　 37.0±10.5*0.8±0.8

2.2不同活化時間TILs對3種腫瘤細胞的殺傷率比較見表2。

2.3 TILs作用前后OC細胞上清液CA-125、CA-153、VEGF、MMP-9水平比較見表3。

表3　 TILs作用前后OC細胞上清液CA-125、CA-153、VEGF、MMP-9水平比較( n =12，±s)

表3　 TILs作用前后OC細胞上清液CA-125、CA-153、VEGF、MMP-9水平比較( n =12，±s)

注:與作用前比較，*P＜0.01。

作用時間　CA-125 ( U/mL) CA-153 ( pg/mL) VEGF ( pg/mL) MMP-9 ( pg/mL)作用前　1 051.4±583.8 115.1±48.9 1 480.0±520.0 1 732.1±560.8作用第14天　240.2±195.7*93.1±50.9　 697.6±273.7*865.7±435.9*

3　討論

TILs是存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)的以淋巴細胞為主的異質(zhì)性淋巴細胞群體，主要包含、T淋巴細胞及NK細胞和LAK細胞等，是近年來腫瘤免疫治療的研究熱點。和T淋巴細胞均對腫瘤細胞具有特異性殺傷活性，而NK 和LAK細胞均具有非特異性殺傷活性。目前，常用的淋巴細胞活化生物制劑包括CD3單抗和IL-2。IL-2屬于淋巴細胞活化因子，主要由和

T淋巴細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細胞因子，可以活化所有T淋巴細胞。新鮮制備的原位TILs 以T細胞為主，主要為具有細胞毒性功能的T淋巴細胞和具有免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細胞。研究發(fā)現(xiàn)，除黑色素瘤和頭頸部腫瘤外，大部分腫瘤中的TILs明顯多于TILs。大量T細胞以及Treg等抑制性T淋巴細胞的存在可導致腫瘤組織內(nèi)的TILs抗瘤活性低下，進而引起腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，有利于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。此外，未成熟樹突狀細胞分泌的吲哚雙氧化酶、精氨酸酶以及腫瘤微環(huán)境中的骨髓來源抑制細胞也可抑制TILs的活化［11］。本研究結(jié)果顯示，OC組織中初分離的TILs尚處于抑制狀態(tài)，經(jīng)IL-2誘導活化、擴增后，TILs細胞明顯增多，比TILs增多更為明顯，前者發(fā)揮著主導地位，提示TILs細胞在OC的殺瘤機制中起主要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，從免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中分離出的TILs，在經(jīng)體外活化擴增后可以明顯增強其對腫瘤細胞及支持腫瘤細胞生長的血管內(nèi)皮細胞的特異性殺傷力［12］。因此，通過分離活化擴增腫瘤組織內(nèi)的具有殺瘤活性的TILs，然后再回輸至患者體內(nèi)可以特異性的殺傷腫瘤，從而提高患者生存率。盡管如此，但TILs的個體化差異很大，每例腫瘤組織內(nèi)提取的TILs對腫瘤的特異性反應(yīng)也不一致。目前研究表明，除黑素瘤TILs具有較強的自身腫瘤特異性殺傷作用以外，其他腫瘤來源的TILs未表現(xiàn)出明顯地抗自身腫瘤的特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，活化前的TILs對3種腫瘤細胞都表現(xiàn)出較低的殺傷力，但是IL-2誘導活化擴增后的，TILs具有良好的特異性抗瘤活性;活化第14天的TILs與OC組共培養(yǎng)后，上清液中CA-125、VEGF、MMP-9下降明顯，提示TILs通過對OC細胞的殺傷作用從而使OC細胞分泌腫瘤標志物及腹水形成因子的能力明顯下降。TILs在過繼性治療腫瘤中的作用機制，主要與其中的細胞毒性T淋巴細胞有關(guān);此外，也有研究表明激活的T淋巴細胞還可表達膜凋亡配體Fasl，通過與腫瘤細胞表達的Fas受體結(jié)合，從而導致腫瘤細胞發(fā)生凋亡［13］。盡管TILs細胞具有較強的抗瘤活性，但從腫瘤組織中高效分離出TILs以及將TILs活化擴增至理想治療量仍缺乏快速、有效的方法。OC組織松脆，細胞易分離。本研究采用聯(lián)合消化法分離獲得TILs細胞，在體外活化擴增14 d后即可達臨床有效治療劑量，較既往研究報道的培養(yǎng)時間( 4周)更快［14］。

綜上所述，OC來源的TILs具有抗腫瘤活性;低濃度IL-2可活化擴增TILs并增強其特異性和非特異性抗瘤活性。

參考文獻:

［1］Cohen CA，Shea AA，Heffron CL，et al.The parity-associated microenvironmental niche in the omental fat band is refractory to ovarian cancer metastasis［J］.Cancer Prev Res ( Phila)，2013，6 ( 11) : 1182-1193.

［2］Rosenberg SA，Spiess P，Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes［J］.Science，1986，233( 4770) : 1318-1321.

［3］Besser MJ，Shapira-Frommer R，Treves AJ，et al.Clinical responses in a phase II study using adoptive transfer of short-term cultured tumor infiltration lymphocytes in metastatic melanoma patients［J］.Clin Cancer Res，2010，16( 9) : 2646-2655.

［4］Shablak A，Hawkins RE，Rothwell DG，et al.T cell-based immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma: modest success and future perspective［J］.Clin Cancer Res，2009，15 ( 21) : 6503-6510.

［5］Dudley ME，Yang JC，Sherry R，et al.Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens［J］.J Clin Oncol，2008，26( 32) : 5233-5239.

［6］Li Y，Yang GL，Yuan HY，et al.Effects of perioperative cimetidine administration on peripheral blood lymphocytes and tumor infiltrating lymphocytes in patients with gastrointestinal cancer: results of a randomized controlled clinical trial［J］.Hepatogastroenterology，2005，52( 62) : 504-508.

［7］Gardini A，Ercolani G，Riccobon A，et al.Adjuvant，adoptive immunotherapy with tumor infiltrating lymphocytes plus interleukin-2 after radical hepatic resection for colorectal liver metastases: 5-year analysis［J］.J Surg Oncol，2004，87( 1) : 46-52.

［8］王玉玲.TIL細胞聯(lián)合IL-2腹腔注射治療卵巢癌腹水12例［J］.山東醫(yī)藥，2002，42( 24) : 14.

［9］Tran KQ，Zhou J，Durflinger KH，et al.Minimally cultured tumorinfiltrating lymphocytes display optimal characteristics for adoptive cell therapy［J］.J Immunother，2008，31( 8) : 742-751.

［10］Santin AD，Bellone S，Palmieri M，et al.Restoration of tumor specific human leukocyte antigens class I-restricted cytotoxicity by dendritic cell stimulation of tumor infiltrating lymphocytes in patients with advanced ovarian cancer［J］.Int J Gynecol Cancer，2004，14( 1) : 64-75.

［11］Muller AJ，Scherle PA.Targeting the mechanisms of tumoral immune tolerance with small-molecule inhibitors［J］.Nat Rev Cancer，2006，6( 8) : 613-625.

［12］Lee S，Margolin K.Tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma ［J］.Curr Oncol Rep，2012，14( 5) : 468-474.

［13］Whiteside TL.Tumor-induced death of immune cells: its mechanisms and consequences［J］.Semin Cancer Biol，2002，12( 1) : 43-50.

［14］Santoiemma PP，Powell DJ.Tumor infiltrating lymphocytes in ovarian cancer［J］.Cancer Biol Ther，2015，16( 6) : 807-820.

收稿日期:( 2015-04-03)

通信作者簡介:梁衛(wèi)江( 1963-)，女，主任醫(yī)師，教授，研究方向為婦科腫瘤的臨床診治及應(yīng)用基礎(chǔ)。E-mail: wjliang22@126.com

作者簡介:第一馬丹宇( 1986-)，女，碩士，研究方向為婦科惡性腫瘤的基礎(chǔ)和臨床。E-mail: madanyu86@126.com

基金項目:廣東省科技計劃資助項目( 2011B031800042)。

文章編號:1002-266X( 2015) 30-0011-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.004