樹突狀細胞疫苗對小鼠膀胱癌模型抑瘤效應研究

郭路生　張麗娜　楊寧江

樹突狀細胞疫苗對小鼠膀胱癌模型抑瘤效應研究

郭路生1張麗娜2楊寧江1

【摘要】目的 探討負載MB49細胞粗提全抗原的樹突狀細胞（DC2.4）疫苗對C57BL/6小鼠膀胱癌MB49皮下移植瘤模型的抑瘤效果。方法 制備負載MB49細胞粗提全抗原的DC疫苗；建立小鼠MB49膀胱癌皮下移植瘤模型。造模后第7 d、14 d，疫苗組小鼠于右前腋皮下注射疫苗，PBS對照組相應注射PBS，正常組正常飼養。造模第21 d，測量腫瘤體積和重量。應用免疫組化染色方法檢測腫瘤組織內CD4+、CD8+細胞數。應用SPSS13.0統計分析測量數據。結果 DC疫苗組和PBS對照組小鼠腫瘤體積隨時間呈現不同程度增長趨勢，DC疫苗組緩于PBS對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；造模21 d，DC疫苗組小鼠腫瘤重量小于PBS對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；免疫組化染色檢測小鼠腫瘤組織內CD4+、CD8+T細胞數，DC疫苗組CD4+、CD8+T細胞數高于PBS對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論 DC2.4樹突狀細胞疫苗抑制了模型小鼠腫瘤的生長，起到了抗腫瘤的免疫學效應。

【關鍵詞】樹突狀細胞疫苗；MB49細胞；膀胱癌模型；免疫組織化學染色

作者單位：1 132013吉林，吉林醫藥學院附屬醫院；2 132013吉林，吉林醫藥學院護理學院

基金資助：吉林市科技計劃項目（201133103）

Study on Tumor Suppressor Effect of Dendritic Cell Vaccine in Mouse Bladder Cancer Model

GUO Lusheng1ZHANG Li’na2YANG Ningjiang1, 1 The affiliated hospital of Jilin Medical University, Jilin 132013, China, 2 Department of nursing, Jilin Medical University, Jilin 132013, China

[Abstract]Objective To investigate the antitumor effect of dendritic cell vaccine against C57BL/6 cells loaded with MB49 cells in MB49 mice. Methods DC vaccine against MB49 cells were prepared by loading MB49 cells, and the model was established in mice. After making the model, the 7 d, 14 d, the vaccine were injected in right anterior axillary of vaccine group mice, and the mice of PBS control group were injected with PBS, normal feeding to normal group. 21 d after modeling, measurement of the volume and weight of the tumor. The number of CD4+and CD8+

cells in tumor tissues was detected by immunohistochemical staining. SPSS13.0 statistical analysis of measurement data. Results The tumor volume of DC vaccine group and PBS control group showed different degrees of growth trend, DC vaccine group was significantly slower than that in 21 d control group(P<0.01). The tumor weight was significantly less than that in DC group(P<0.01). In tumor tissue of CD4+and CD8+

T cell number and DC vaccine group of CD4+, CD8+

T cell number higher than the PBS control group. The difference was statistically significant(P < 0.01). Conclusion DC2.4 dendritic cell vaccine inhibits tumor growth in mouse model, which has the effect of anti-tumor.[Key words]Dendritic cell vaccine, MB49 cells, Bladder cancer models, Immunohistochemical staining

膀胱癌是泌尿系統發病率最高的惡性腫瘤，且有逐年增高的趨勢；其發病率僅次于前列腺癌，居泌尿系統腫瘤的第二位[1]。膀胱癌也被認為是最有希望通過免疫和基因療法治療的疾病[2]。近年來，DC疫苗在實驗室中廣泛應用于治療腫瘤的研究，在臨床上，也已試驗性的應用于腫瘤的治療[3-4]。本課題探討DC2.4細胞疫苗在MB49小鼠膀胱癌皮下移植瘤模型中的抑瘤效應。

1　材料

1.1DC2.4、MB49細胞，受贈于遼寧醫學院張佩教授。

1.2C57BL/6近交系雌性小鼠36只，8～12周齡，體重18～20 g，雌性，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[許可證編號：SCXK（滬）2012-0005]。

1.3Anti-CD4、Anti-CD8、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP購自北京博奧森生物技術有限公司。

2　方法

2.1小鼠膀胱癌MB49細胞皮下移植瘤模型的建立[5-6]

36只小鼠，按隨機數字表法選擇其中24只小鼠用于模型建立，另外12只小鼠作為正常對照。取對數期生長的MB49細胞，用PBS調整細胞濃度為5×106/ml。將細胞懸液注射于小鼠右前腋皮下，每只0.2 ml（1×106個細胞）。

2.2DC2.4疫苗接種膀胱癌MB49細胞皮下移植瘤模型小鼠

24只模型小鼠按隨機數字表法分為兩組：疫苗組和PBS對照組，每組12只。12只正常飼養小鼠作為正常組。收集DC2.4疫苗細胞，調整細胞濃度至1×106/ml，模型小鼠分別于接種腫瘤細胞后第7 d、14 d給予相應治療：DC疫苗組給予DC2.4疫苗0.1 ml+PBS 0.1 ml（1×105細胞），PBS對照組給予PBS 0.2 ml，分別注射于小鼠接種腫瘤細胞處的皮下。正常組正常飼養。

2.3腫瘤體積和重量的檢測

于造模第7 d、10 d、14 d、17 d、21 d，用卡尺測定腫瘤的長徑a和短徑b，按V=1/2ab2算出腫瘤體積。造模第21 d，頸椎脫臼法處死各組小鼠，用天秤稱量腫瘤質量。

2.4免疫組化染色檢測小鼠腫瘤組織浸潤CD4+、CD8+細胞數

制備石蠟包埋腫瘤組織切片，采用Envision兩步法免疫組化染色。免疫組化圖像系統分析組化片，選取炎癥壞死區組織，400倍鏡下，隨機選取15個視野，計數CD4+和CD8+細胞數。

2.5統計學方法

應用SPSS13.0軟件進行數據處理和統計學分析，兩組間均數比較采用隨機分組t檢驗。

3　實驗結果

3.1小鼠腫瘤體積和重量的變化比較

DC疫苗組和PBS對照組小鼠腫瘤體積隨時間呈現不同程度增長趨勢，DC疫苗組緩于PBS對照組，差異有統計學意義（P ＜0.01）；造模21 d，DC疫苗組小鼠腫瘤重量小于PBS對照組，差異有統計學意義（P＜0.01） ，見表1、圖1。

3.2免疫組織化學染色檢測小鼠腫瘤組織浸潤CD4+、CD8+細胞數

疫苗組CD4+和CD8+T淋巴細胞數均高于PBS對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。各組選取1張免疫組化照片進行比較，見圖2。

圖1　疫苗組和PBS對照組腫瘤體積變化

圖2　PBS對照組與DC組瘤組織CD4+陽性和CD8+陽性細胞表達比較（×400倍）

表1　造模21 d小鼠腫瘤體積和重量測量結果[n=12，

表2　免疫組化檢測腫瘤組織CD4+、CD8+細胞數 [n=15，（x-±s），陽性細胞數/400倍鏡]

4　討論

T細胞介導的細胞免疫在機體抗腫瘤效應中起重要作用。參與抗瘤效應的T細胞包括多個亞群，最主要的是T細胞。

DC2.4樹突狀細胞疫苗激活了疫苗組小鼠體內靜息T淋巴細胞，促進了T細胞活化并有大量CD+T細胞增殖，同時促進4CTL成熟及活化。

免疫組化染色結果說明由于DC2.4疫苗的作用，模型小鼠自身免疫系統被激活，疫苗組小鼠體內趨化遷移至腫瘤組織的CD4+、CD8

+T淋巴細胞數顯著增多。通過比較各組小鼠腫瘤體積變化和造模后21 d腫瘤質量，初步證明DC2.4疫苗在小鼠MB49膀胱癌皮下移植瘤模型中起到了抑制腫瘤發展的免疫學效應。

參考文獻

[1]Uchio EM，Linehan WM，Figg WD，et al. A phase I study of intravesical suramin for the treatment of superficial transitional cell carcinoma of the bladder[J]. J Urol.，2003，169（1）：357-360.

[2] Loskog A，Ninalga C，Hedlund T，et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy[J]. Lab Anim，2005，39（4）：384-393.

[3] Sakai K，Shimodaira S，Maejima S，et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms’ tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma[J]. J Neurosurg，2015，7：1-9.

[4] Anguille S，Smits EL，Bryant C，et al. Dendritic Cells as Pharmacological Tools for Cancer Immunotherapy[J]. Pharmacol Rev.，2015，67（4）：731-753.

[5] Günther JH，Jurczok A，Wulf T，et al. Optimizing Syngeneic Orthotopic Murine Bladder Cancer(MB49)[J]. Cancer Res.，1999，59（12）：2834-2837.

[6] 梁中錕，張琳，胡志明，等. 新方法簡便高效建立小鼠原位膀胱癌模型[J]. 南方醫科大學學報，2009，29（4）：627-630.（x-±s）]

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.24.149

【文章編號】1674-9308（2015）24-0211-02

【文獻標識碼】B

【中圖分類號】R737.1