單一位點夾心抗體法結合循環增強熒光免疫技術檢測BNP的評估

肖春海，　梁　爽，　劉靜凡，　李飛飛，　朱慶華，　瞿培培，　董志武

單一位點夾心抗體法結合循環增強熒光免疫技術檢測BNP的評估

肖春海，梁爽，劉靜凡，李飛飛，朱慶華，瞿培培，董志武

(上海市第六人民醫院金山分院檢驗科，上海 201500)

摘要：目的初步評價單一位點夾心抗體(SES)法結合循環增強熒光免疫技術(CEIFA)檢測B型鈉尿肽(BNP)的性能。方法用SES法結合CEIFA儀檢測BNP，對其精密度、線性范圍、功能敏感性、回收率、樣本穩定性及與西門子ADVIA Centaur CP化學發光儀(簡稱Centaur CP)的相關性進行評估。結果SES法結合CEIFA的批內和批間變異系數(CV)分別為4.38%～7.84%和10.47%～11.21%。線性范圍為25～5 000 pg/mL。功能敏感性為12.5 pg/mL。回收率為95.04%～109.2%。與Centaur CP比較，其回歸方程為Y=0.998 3X-22.38(r=0.969，P<0.01)。對樣本穩定性的要求低于Centaur CP。結論SES法結合CEIFA測定BNP具有較好的性能，與傳統的雙抗體夾心發光法比較有一定優勢，適合臨床急診實驗室使用。

關鍵詞：B型鈉尿肽；單一位點夾心抗體；熒光免疫分析；心力衰竭

Evaluation of BNP quantification by single-epitope sandwich combined with cyclic enhanced immunofluorescent assayXIAOChunhai，LIANGShuang，LIUJingfan，LIFeifei，ZHUQinghua，QUPeipei，DONGZhiwu

.(DepartmentofClinicalLaboratory，JinshanBranchofShanghaiSixthPeople′sHospital，Shanghai201500，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate B-type natriuretic peptide quantification by single-epitope sandwich(SES)combined with cyclic enhanced immunofluorescent assay(CEIFA). MethodsBy SES combined with CEIFA, BNP was determined. The precision, linear range, function sensitivity, recovery rate and sample stability were evaluated, and 45 samples were determined by the method, which the results were evaluated with those of SIEMENS ADVIA Centaur CP chemiluminescence analyzer (Centaur CP). ResultsThe within-run and between-run coefficients of variation(CV) were 4.38%-7.84% and 10.47%-11.21%, respectively. The linear range was 25-5 000 pg/mL. The function sensitivity was 12.5 pg/mL. The recovery rate was 95.04%-109.2%. The correlation formula between the novel method and Centaur CP was Y=0.998 3X-22.38 (r=0.969, P<0.01). The request of sample stability of SES combined with CEIFA was lower than that of Centaur CP. ConclusionsSES combined with CEIFA for BNP quantification has a good performance, and there are some advantages compared with traditional double-antibody sandwich chemiluminescence assay.

Key words:B-type natriuretic peptide; Single-epitope sandwich; Immunofluorescent assay; Heart failure

B型鈉尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)屬于利鈉肽家族，由日本學者首先從豬腦中分離出來，但卻主要由心室肌細胞分泌，與左心室承受的壓力大小密切相關，所以現在更多稱“B型利鈉肽”。人類BNP基因位于1號染色體端臂遠端，包括2個內含子和3個外顯子。BNP前體(BNP precursor, proBNP)裂解后同時產生具有環狀結構的BNP和氨基末端碎片(N-terminal proBNP，NT-proBNP)，兩者都可作為心力衰竭診斷的有效特異指標[1-3]。BNP雖然在診斷呼吸困難、肺栓塞、肺癌等疾病的過程中發揮重要作用[4-6]，但目前應用較多的仍為心血管領域[1-3，7-10]。我們主要是利用循環增強熒光免疫技術(cyclic enhanced immunofluorescent assay, CEIFA)結合單一位點夾心抗體(single-epitope sandwich，SES)法[11]實現BNP的檢測。

材料和方法

一、材料

1. 研究對象45份上海市第六人民醫院金山分院心內科患者的乙二胺四乙酸二鉀鹽新鮮抗凝血漿；星童公司BNP標準品，濃度為100、1 000和5 000 pg/mL。

2.試劑與儀器西門子ADVIA Centaur CP化學發光儀(簡稱Centaur CP)及其配套BNP試劑盒(批號35890171)，星童Pylon Core熒光免疫分析儀(簡稱Pylon Core) 及其配套BNP試劑盒(批號000502191411)和BNP稀釋液(批號000502181529)。

二、原理

1. CEIFA原理將氣化的3-氨基丙基硅烷均勻鍍在石英針表面，在疏水作用下可以將單克隆抗體固化在石英針的表面，形成捕捉抗體。通過二甲基甲酰胺分別將生物素與另一單克隆抗體偶聯形成生物素化抗體，將熒光素(花青染料5)與多聚糖-鏈霉親和素偶聯成熒光素-多聚糖-鏈霉親和素復合物。CEIFA利用生物素化的捕捉抗體對待測抗原的特異性以及對鏈霉親和素熒光偶聯物質的特異性，通過循環反應實現熒光信號的循環放大。見圖1。

2. SES原理SES由HyTest公司發明，利用BNP環抗體能特異結合BNP的環狀結構的11～16位氨基酸，形成新的抗原抗體復合物，同時此復合物能作為抗原，形成新的抗原特異位點，與此復合物的抗體特異性結合，從而實現針對一個單克隆抗原位點的特異性夾心反應。見圖2。

3. CEIFA與SES法結合檢測BNP的過程固化后的BNP單克隆抗體作為捕捉抗體與樣本中完整的BNP分子和部分降解的BNP分子進行結合，清洗后與另一生物素化BNP單克隆抗體進行雙抗體夾心反應，清洗后再與熒光素-多聚糖-鏈霉親和素反應，之后再分別與生物素化BNP單克隆抗體和熒光素-多聚糖-鏈霉親和素反應循環3次，實現熒光信號的放大，進行檢測。見圖3。

三、方法

1.精密度試驗準備2個批號的BNP試劑，取BNP濃度為100 pg/mL的低值和1 000 pg/mL的高值標準品每天測3次，連續測定5 d，根據測得BNP的結果計算濃度的批內和批間的變異系數(coefficient of variation,CV)[12]。

圖1CEIFA原理圖

圖2　SES原理圖

圖3　CEIFA結合SES法檢測BNP的過程圖

2.線性試驗取5 000 pg/mL標準品進行對倍稀釋，每個稀釋度重復測定3次，計算平均值。將實際測定的均值與理論值進行比較，計算相關系數(r)，相對偏差應<15%。

3.功能敏感性對100 pg/mL的標準品進行對倍稀釋，濃度依次為50.00、25.00、12.50和6.25 pg/mL，-80℃低溫分裝保存，每天測定4次，連續5 d。

4.回收試驗在150 μL患者的待測血清中，分別加入BNP濃度為100和2 500 pg/mL的標準液50 μL，檢測標準液加入前后樣本的BNP濃度?；厥章?%)=(加入標準液后BNP質量-加入標準液前BNP質量)/實際加入的BNP質量×100。

5.相關性試驗45例臨床樣本在Centaur CP上檢測的BNP值為35 ～2 435 pg/mL，同時在Pylon Core上檢測，計算兩者的相關性。

6.樣本穩定性試驗將3份急診患者的樣本同時在Centaur CP和Pylon Core上檢測BNP，之后每隔2 h再分別在2臺儀器上同時檢測BNP，共檢測5次，總時長為8 h。

四、統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行t檢驗、兩變量相關性和回歸分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、精密度試驗

低值標準品(100 pg/mL)和高值標準品(1 000 pg/mL)批內和批間的BNP測定值均符合正態分布(P>0.05)，低、高值標準品批內CV分別為4.38%和7.84%，均<10%；批間CV分別為11.21%和10.47%，均<15%。

二、線性試驗

將高值(5 000 pg/mL)、中值(1 000 pg/mL)和低值(100 pg/mL)的標準品進行一定倍數的稀釋，然后進行檢測。相對偏差均<15%，線性方程為Y=1.033X-3.348，r=0.999 8，線性范圍為25 ～5 000 pg/mL。見表1。

三、功能敏感性

50.00、25.00、12.50和6.25 pg/mL 4種濃度中，12.5 pg/mL的CV為19.5%，最接近20%，所以此方法的功能敏感性為12.5 pg/mL。

四、回收試驗

經檢測，加入標準液前被檢測樣本的BNP濃度為258 pg/mL，加入標準液后樣本的檢測濃度分別為220.8和787.5 pg/mL。計算得平均回收率為102.12%。見表2。

五、相關性試驗

45份樣本在Centaur CP和Pylon Core上檢測BNP的回歸方程為Y=0.998 3X-22.38(r=0.969，P<0.01)。見圖4。進行配對t檢驗，t=1.175，P>0.05。

六、樣本穩定性試驗

取BNP高、中、低值各3份樣本，Pylon Core最初檢測結果分別為1 739、421和95 pg/mL，Centaur CP分別為1 709、415和93 pg/mL。每隔2 h測定BNP。隨著時間的延長，2種儀器的檢測結果均逐漸降低，但Pulon Core檢測值的降低速度明顯沒有Centaur CP快。見表3、圖5。

表1　BNP線性試驗結果

表2　CEIFA結合SES法檢測BNP的回收試驗結果

注：Y=0.998 3X-22.38;R2=0.938 9

圖445份樣本在Pylon Core和Centaur CP上檢測BNP的回歸分析

表3　樣本穩定性試驗結果　(pg/mL)

注：與同一樣本Pylon Core均值比較， *P<0.05

時間(h)

圖5樣本穩定性的變化趨勢

討論

心力衰竭患者心室負荷增加時，心肌細胞分泌的proBNP由108個氨基酸組成，之后水解成為76個氨基酸的NT-proBNP和32個氨基酸的BNP[7]，所以BNP和NT-proBNP都可以作為心力衰竭的診斷指標，但目前2個指標各有優缺點。BNP半衰期短，不穩定，體內半衰期只有20 min，體外室溫下2 h內測試結果可靠[11]，而NT-proBNP較BNP穩定，體外24 h內結果可靠[13]。由于NT-proBNP代謝主要通過高血流量的器官，如肝臟和腎臟等清除，而BNP主要通過鈉尿肽清除受體結合經胞吞和溶酶體降解等方式進行代謝，只有少量通過腎臟清除，所以腎功能對于NT-proBNP影響很大，對BNP的影響則較小[14-15]。而心血管疾病的慢性患者多伴有不同程度的腎功能損害，NT-proBNP半衰期長，容易造成體內NT-proBNP的積累，體外檢測時往往不能真實反映腎功能異?；颊咝募〉氖軗p程度。BNP半衰期短，不穩定，如果BNP能及時檢測，其結果對臨床的可靠性會高于NT-proBNP，因為BNP更能反映患者當前心肌的受損情況。

本研究利用CEIFA實現了抗體的固化，循環反應的特點實現了信號的放大。CEIFA檢測BNP具有良好的批內和批間精密度，其CV分別<10%和<15%。線性范圍為25～5 000 pg/mL，功能敏感性為12.5 pg/mL，說明此方法具有敏感性高、信號放大明顯等特點。本研究對此方法進行了BNP的加樣回收試驗和臨床樣本的相關性分析,結果顯示CEIFA檢測BNP的準確性良好(平均回收率為102.12%)，與Centaur CP的相關性較好(r=0.969,P<0.01)。

BNP分子免疫反應的特異性位點一般有3個可以選擇，分別是中間的環狀結構以及碳端和氮端。而傳統的雙抗體夾心法通常選擇其中的2個位點進行反應。在樣本穩定性試驗過程中，隨著時間的推移，Pylon Core檢測BNP的結果降低程度明顯沒有Centaur CP快，在高值樣本中尤為明顯，因為此結果的產生與SES技術有著密切的關系。由于BNP分子的兩端降解速度比環部快，環部相對比較穩定，Centaur CP檢測BNP時其中一個單克隆抗體的結合位點為碳端的27～32氨基酸[15]，不穩定的碳端一旦水解，則不能完成雙抗體夾心的反應，從而降低BNP的結合率，使檢測結果降低。有報道顯示BNP的體外穩定性一般在2 h之內[11,13]。如果所有樣本均在2 h之內進行檢測，對結果的影響不大。本研究的BNP檢測結合了SES法，檢測的結合位點位于相對穩定的環部(11～16氨基酸)，形成抗原抗體復合物，以此復合物作為抗原，形成新的特異性位點，再與另一特異性抗體反應，完成了單一位點的雙抗體夾心反應[11,16]。由此可見，SES技術在BNP檢測過程中能減緩BNP的降解對于結果的影響，能為臨床提供更加準確的結果。

本研究的BNP檢測法是SES法和CEIFA的結合，具有較好的檢測性能，同時相對于傳統的雙抗體夾心法有一定的優勢，所以SES法結合CEIFA檢測BNP具有一定的臨床推廣價值，適合臨床急診實驗室使用。

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(本文編輯：姜敏)

收稿日期：(2014-12-08)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0495-05R446.61

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.020

通訊作者：董志武，聯系電話：021-57331227。

作者簡介：肖春海，男，1976年生，碩士，主管技師，主要從事臨床生化與免疫檢驗研究。

基金項目：金山區科學技術創新資金資助項目(2014-3-09)