不同培養(yǎng)條件下透析液和反滲水微生物監(jiān)測(cè)的比較分析

周悅昌，　任麗娜，　王旭輝，　陳建文，　陳妙佩，　毛鴻忠，　韓立杰

不同培養(yǎng)條件下透析液和反滲水微生物監(jiān)測(cè)的比較分析

周悅昌1，任麗娜1，王旭輝1，陳建文3，陳妙佩3，毛鴻忠3，韓立杰2

(1. 牡丹江巿第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 牡丹江 157000；

2. 牡丹江巿第二人民醫(yī)院血液凈化中心，黑龍江 牡丹江 157000；

3. 屏基醫(yī)療財(cái)團(tuán)法人屏東基督教醫(yī)院教學(xué)研究部腎臟科研究小組，臺(tái)灣 屏東 811)

摘要：目的比較不同培養(yǎng)基、孵育溫度及培養(yǎng)時(shí)間的選擇對(duì)透析液和反滲水微生物監(jiān)測(cè)總菌落計(jì)數(shù)的差異，確認(rèn)透析液和反滲水微生物監(jiān)測(cè)的最佳培養(yǎng)條件。方法采用無菌透析液和無菌反滲水配置模擬污染水樣本，傾注法接種于伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、大豆酪蛋白瓊脂(TSA)、胰蛋白胨葡萄糖浸液(TGEA)培養(yǎng)基，于25℃和35℃分別進(jìn)行培養(yǎng)，并記錄培養(yǎng)48、72 h及7 d的生長(zhǎng)情況。結(jié)果不論是25℃還是35℃，TGEA的生長(zhǎng)情況均最佳且最接近預(yù)期菌落數(shù)(P<0.05)；各種培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h比48 h生長(zhǎng)好(P<0.05)；培養(yǎng)7 d后的菌落數(shù)與培養(yǎng)72 h比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論使用傾注平板法及TGEA培養(yǎng)基對(duì)透析液和反滲水進(jìn)行微生物監(jiān)測(cè)，需同時(shí)在25℃及35℃條件下培養(yǎng)至少72 h，方可產(chǎn)生有效的監(jiān)測(cè)報(bào)告，確保患者的透析安全。

關(guān)鍵詞：血液透析液；反滲水；總菌落數(shù)計(jì)算

Comparison analysis of microbiological monitoring between hemodialysate and reverse osmosis water under different mediaZHOUYuechang1，RENLina1，WANGXuhui1，CHENJianwen3，CHENMiaopei3，MAOHongzhong3，HANLijie2

.(1.DepartmentofClinicalLaboratory，theSecondPeople′sHospitalofMudanjang，HeilongjiangMudanjiang157000,China； 2.BloodPurificationCenter，theSecondPeople′sHospitalofMudanjang，HeilongjiangMudanjiang157000,China； 3.TeamofNephrologicalResearch,DepartmentofMedicalResearch，PingtungChristianHospital，TaiwanPingtung811,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the difference between media， incubation temperatures and culture times on the choice of hemodialysate and reverse osmosis water for microbiological monitoring of heterotrophic plate count， and further to confirm the best culture method of microbiological monitoring for hemodialysate and reverse osmosis. MethodsThe polluted samples were simulated by using sterile dialysate and sterile reverse osmosis water， and then were incubated in 25℃ and 35℃ with eosin methylene blue agar(EMB)， tryptone soy agar(TSA) and tryptone glucose extract agar(TGEA)for 48 h， 72 h and 7 d， respectively. ResultsEither on 25℃ or 35℃， the bacteria′s growth condition in TGEA was better than those under other conditions(P<0.05). The colony numbers of 72 h incubation were more than those of 48 h incubation in all media(P<0.05). However， there was no statistical significance of colony numbers between 7 d incubation and 72 h incubation(P > 0.05). ConclusionsThe microbiological monitoring for hemodialysate and reverse osmosis water needs to use pour plate method with TGEA， incubating in 25℃ and 35℃ for 72 h， which may provide the effective reports for ensuring the safety of hemodialysis patients.

Key words:Hemodialysate; Reverse osmosis water; Heterotrophic plate count

血液透析主要是靠血液與透析液在半透膜間進(jìn)行彌散作用移除尿毒素，水是很好的溶劑，但進(jìn)行高通量血液透析時(shí)微生物及其代謝產(chǎn)物會(huì)通過反彌散作用(back filtration)或透析器破膜方式進(jìn)入血液，特別是當(dāng)以透析液做為補(bǔ)充液時(shí)，微生物及其代謝產(chǎn)物更會(huì)直接進(jìn)入人體[1-2]，導(dǎo)致菌血癥和膿毒血癥的發(fā)生。因此，要避免血液透析帶來的長(zhǎng)期慢性微發(fā)炎反應(yīng)，讓透析更安全，透析液的微生物監(jiān)測(cè)是血液透析質(zhì)量達(dá)標(biāo)的第一步[3]。

目前，透析液和反滲水的微生物培養(yǎng)普遍存在敏感性低、假陰性率高的情況，造成臨床上低估透析液和反滲水的污染問題，增加了透析患者的安全隱患。各國(guó)對(duì)透析液和反滲水的微生物含量雖訂有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，但檢驗(yàn)方式、培養(yǎng)方法及采樣方式仍存在很大的差別。培養(yǎng)基與培養(yǎng)時(shí)間不同得到的結(jié)果也不同[4]；水生細(xì)菌適合在乏營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中反而生長(zhǎng)緩慢，甚至不能存活[5-6]；不同的孵育溫度和時(shí)間，培養(yǎng)的結(jié)果也會(huì)有所差異[7-8]，如22℃培養(yǎng)7 d、37℃培養(yǎng)2 d或30℃培養(yǎng)5 d[9-11]。因此，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物指標(biāo)不超標(biāo)，并不代表真的不超標(biāo)。2001年EDTA best practice guideline、2003年國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)(International Society of Nephrology， ISN)及2005年德國(guó)衛(wèi)生指南(German hygiene guideline)推薦使用胰蛋白胨葡萄糖浸液瓊脂(tryptone glucose extract agar， TGEA)[5，9，12]。對(duì)于總菌落數(shù)計(jì)數(shù)，美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)(American Public Health Association, APHA)推薦以傾倒平板法做為水培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法[6，13]。

我們采用2種不同菌落數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)菌液，以傾倒平板法接種于3種不同的培養(yǎng)基，分25℃及35℃進(jìn)行培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)48、72 h及7 d的生長(zhǎng)情況，以確認(rèn)最佳的培養(yǎng)條件，供透析液和反滲水微生物監(jiān)測(cè)使用。

材料和方法

一、材料

1.標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853e。

2.培養(yǎng)基大豆酪蛋白瓊脂(tryptone soy agar, TSA)、伊紅美藍(lán)瓊脂(eosin methylene blue agar, EMB)、TGEA。

3.主要儀器法國(guó)生物梅里埃公司DensiCHEK plus比濁儀、生物安全柜、細(xì)菌培養(yǎng)箱、振蕩器。

二、方法

1.采樣(1)透析液采集(透析機(jī)采樣)：以酒精消毒橡膠采樣閥30 s，全新注射器抽取管路中的透析液，放入無菌收集瓶(采樣方式見圖1)；(2)反滲水采集：以酒精消毒采集口，放入無菌收集瓶后經(jīng)高溫高壓滅菌確保達(dá)到無菌狀態(tài)。二者使用前先置于254 nm紫外線下照射8 h，確保殺滅可能的微生物[14]。

2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(1)采用無菌透析液和無菌反滲水配制濃度為McFarland 0.5的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的菌懸液，再利用無菌透析液和無菌反滲水進(jìn)行稀釋配制，模擬約6和60 CFU/mL菌落數(shù)污染的水樣本(稀釋倍數(shù)分別為25×106和2.5×106)，在振蕩器上溫和混勻，以傾倒平板法接種于TSA、EMB、TGEA培養(yǎng)基，分別于25℃、35℃進(jìn)行培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)48 h、72 h的生長(zhǎng)情況，以無菌透析液和無菌反滲水作為空白對(duì)照；EMB組、TSA組和TGEA組的平行檢測(cè)數(shù)為36；25℃組和35℃組的平行檢測(cè)數(shù)為54；48 h組和72 h組的平行檢測(cè)數(shù)為108，以各組實(shí)際檢測(cè)數(shù)列表，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；(2)僅用金黃色葡萄球菌模擬約6和60 CFU/mL菌落數(shù)污染的水樣，采用傾倒平板法接種于TSA、EMB、TGEA培養(yǎng)基，分別于25℃、35℃進(jìn)行培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)48、72 h及7 d的生長(zhǎng)情況，以無菌透析液和無菌反滲水作為空白對(duì)照；實(shí)驗(yàn)中72 h組和7 d組的平行檢測(cè)數(shù)為36，以各組實(shí)際檢測(cè)數(shù)列表，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖1　采樣方式

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因子變異數(shù)分析比較不同培養(yǎng)基、孵育溫度及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)透析用水總菌落計(jì)數(shù)的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

以TGEA的生長(zhǎng)最佳也最接近預(yù)期菌落數(shù)，其次為TSA，再次為EMB，各組間菌落數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。25℃下各培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況優(yōu)于35℃(P<0.05)。各培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h的生長(zhǎng)情況優(yōu)于48 h(P<0.05)，金黃色葡萄球菌在EMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h未見生長(zhǎng)。見表1、表2。

以金黃色葡萄球菌模擬污染水樣本培養(yǎng)結(jié)果顯示培養(yǎng)7 d的菌落數(shù)與培養(yǎng)72 h比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但菌落明顯變大。見表3、表4、圖2。

表1　模擬污染透析液及模擬污染反滲水在各培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)48、72 h的菌落生長(zhǎng)情況

表2　模擬污染透析液及模擬污染反滲水在25℃各培養(yǎng)基培養(yǎng)48、72 h的菌落生長(zhǎng)情況

表3　以金黃色葡萄球菌模擬污染透析液及反滲水在各培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)48、72 h及7 d的菌落生長(zhǎng)情況

表4　以金黃色葡萄球菌模擬污染透析液及反滲水在各培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)48、72 h及7 d的菌落生長(zhǎng)情況

(a)

(b)

注： (a)透析液，35℃培養(yǎng)； (b)反滲水，35℃培養(yǎng)

圖2模擬污染透析液及模擬反滲水樣本金黃色葡萄球菌(2.5×106CFU/L)在各種培養(yǎng)基48、72 h及7 d培養(yǎng)菌落生長(zhǎng)情況

討論

腎功能替代療法在終末期腎臟疾病的治療技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，而感染卻占慢性血液透析患者死亡率的12%～38%[15]。長(zhǎng)期血液透析的患者每周暴露于約400～600 L的透析液中[4]。目前，高通透量血液透析及在線式血液透析過濾術(shù)被廣泛應(yīng)用，利用大孔徑和大表面積的透析膜來增加中、大分子溶質(zhì)的去除[2，16-17]，但微生物及其代謝產(chǎn)物也會(huì)通過反擴(kuò)散作用進(jìn)入血液[1，4]，加上透析液做為補(bǔ)充液，因此存在更大的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)[2]。革蘭陰性菌可以在所有類型的水樣中生長(zhǎng)，即使是在只含有少量有機(jī)物質(zhì)的反滲水、蒸餾水或去離子水中也會(huì)生長(zhǎng)，而且會(huì)在透析系統(tǒng)中形成生物膜，抵抗消毒并不斷釋放代謝產(chǎn)物[9]。這些細(xì)菌對(duì)血液透析患者的潛在危險(xiǎn)主要表現(xiàn)為兩種方式：一是在適當(dāng)?shù)臈l件下產(chǎn)生菌血癥并導(dǎo)致患者發(fā)生膿毒性休克；二是這些生物的細(xì)胞壁成分含有脂多糖(內(nèi)毒素)，能產(chǎn)生熱原反應(yīng)。

各國(guó)對(duì)透析用水的微生物含量均有標(biāo)準(zhǔn)[18]。美國(guó)腎臟醫(yī)學(xué)會(huì)依據(jù)美國(guó)醫(yī)療儀器協(xié)會(huì)RD52:2004的規(guī)范[19-20]，透析液和反滲水均要求細(xì)菌數(shù)低于200 CFU/mL[2，21]；英國(guó)腎臟醫(yī)學(xué)會(huì)依據(jù)ISO 13959:2001[11]，日本透析治療學(xué)會(huì)依據(jù)ISO 11663:2009[22-24]，均要求細(xì)菌數(shù)低于100 CFU/mL，并每月進(jìn)行微生物監(jiān)測(cè)[2，21，25]。因此，選擇有效的培養(yǎng)基、接種方法、孵育溫度、培養(yǎng)時(shí)間及采樣方式是透析用水微生物監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵。

JACKSON等[13]研究了傾注平板瓊脂[(35±0.5)℃，培養(yǎng)(48±2)h]計(jì)數(shù)與玻片熒光法對(duì)水質(zhì)培養(yǎng)的敏感度，結(jié)果顯示二者相關(guān)性極高(r=0.95， slop=0.99+0.06)。這也相對(duì)證明傾注平板法在透析液及反滲水微生物監(jiān)測(cè)中的優(yōu)勢(shì)。

本研究觀察了EMB、TSA及TGEA培養(yǎng)基在同等條件下培養(yǎng)48、72 h，結(jié)果顯示TGEA培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)最佳，而且在低菌落數(shù)(6 CFU/mL)模擬污染水樣本中依然生長(zhǎng)良好；EMB是選擇性培養(yǎng)基，主要用于分離革蘭陰性腸道致病菌，它可抑制革蘭陽性菌的生長(zhǎng)，故金黃色葡萄球菌在EMB培養(yǎng)48 h觀察未見生長(zhǎng)。由此可見，透析液及反滲水微生物培養(yǎng)時(shí)對(duì)培養(yǎng)基的選擇相當(dāng)重要。各種培養(yǎng)基72 h比48 h生長(zhǎng)好；同樣培養(yǎng)時(shí)間25℃組比35℃組生長(zhǎng)好。在金黃色葡萄球菌模擬污染水樣本培養(yǎng)中，25℃組和35℃組培養(yǎng)7 d的菌落數(shù)均增加不多(見表3)，但菌落明顯增大(見圖2)。

綜上所述，透析液和反滲水微生物監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的選擇TGEA優(yōu)于TSA，而EMB會(huì)抑制革蘭陽性菌的生長(zhǎng)，所以并不適合；培養(yǎng)溫度25℃優(yōu)于35℃；培養(yǎng)時(shí)間72 h優(yōu)于48 h。因此，使用傾注平板法及TGEA培養(yǎng)基對(duì)透析液和反滲水進(jìn)行微生物監(jiān)測(cè)，同時(shí)在25℃及35℃條件下培養(yǎng)至少72 h，方可產(chǎn)生有效的監(jiān)測(cè)報(bào)告，確保患者的透析安全。

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(本文編輯：范基農(nóng))

收稿日期：(2014-10-31)

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)05-0478-06R446.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.017

作者簡(jiǎn)介：周悅昌，男，1978年生，碩士，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。