昆明山海棠對CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達及血清和足爪組織中IL-12、IL-23和IL-37水平的影響

昆明山海棠對CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達及血清和足爪組織中IL-12、IL-23和IL-37水平的影響*

母傳賢1△，劉國玲2

(商丘醫學高等專科學校1臨床醫學系，2生物化學與分子生物學教研室，河南 商丘 476100)

[摘要]目的： 探討昆明山海棠(Tripterygium hypoglaucum Hutch，THH)對膠原性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠的干預作用及可能的機制。方法: SD大鼠50只，隨機分為正常組和膠原性關節炎模型制作組，用雞Ⅱ型膠原誘導制作CIA大鼠模型。將造模成功的36只大鼠隨機分為模型組、地塞米松治療組與THH 200 mg/kg、400 mg/kg干預組。ELISA法檢測CIA大鼠血清和足爪組織中促炎因子IL-12、IL-23和抑炎因子IL-37的含量; HE染色觀察各組大鼠足爪組織病理學變化； Western blot法檢測足爪組織MMP-13蛋白的表達；熒光標記法檢測大鼠足爪組織中MMP-13的活性。結果: 較模型組比較，THH 400 mg/kg治療組大鼠體重下降明顯減輕(P<0.01)，血清中IL-12 和IL-23的水平分別降低了28.31%和41.57%(P<0.01)，足爪組織中IL-12 和IL-23的含量分別下降了30.78%和39.46%，而血清和足爪組織中IL-37的水平顯著升高了79.43%和75.78%(P<0.01)，足爪皮下組織病理變化明顯減輕，足爪組織中MMP-13蛋白表達降低了49.22%(P<0.01)，且MMP-13活性明顯下降。而THH 200 mg/kg治療組大鼠上述指標無明顯改善。結論: THH對CIA大鼠炎癥的明顯抑制作用可能與其降低促炎因子IL-12 和IL-23、增高抑炎因子IL-37含量，抑制炎性細胞浸潤及血管增生、下調MMP-13蛋白表達、降低MMP-13活性有關。

[關鍵詞]昆明山海棠； 類風濕性關節炎； 基質金屬蛋白酶13； 白細胞介素

[中圖分類號]R363.2; R285.5[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.027

[文章編號]1000-4718(2015)11-2096-05

[收稿日期]2015-05-06[修回日期] 2015-08-24

[基金項目]*河北省科技支撐計劃(No. 11276103D-84)

通訊作者△牛春雨 Tel: 0313-4029168; E-mail： ncylxf@126.com； 劉圣君 Tel: 0313-8046920; E-mail： lyz19920206@sohu.com

Effect ofTripterygiumhypoglaucumHutch on MMP-13 protein expression and IL-12, IL-23 and IL-37 levels in serum and foot paws of rats with collagen-induced arthritisMU Chuan-xian1, LIU Guo-ling2

(1DepartmentofClinicalMedicine,2DepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,ShangqiuMedicalCollege,Shangqiu476100,China.E-mail:sqyzmcx@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the effect of tripterygium hypoglaucum Hutch (THH) on collagen-induced arthritis (CIA) in rats and its possible mechanism. METHODS: SD rats were randomly divided into normal group and CIA group. The rat model of type II CIA was successfully established and the model rats were randomly divided into 4 different groups: model group, dexamethasone group, THH (200 mg/kg) group, and THH (400 mg/kg) group. The contents of IL-12, IL-23 and IL-37 in the serum and foot paws of the CIA rats were detected by ELISA. The histopathological changes of the skin of the food paws were observed by HE staining. The protein expression of MMP-13 was determined by Western blot. The MMP-13 activity in the foot paws was detected by fluorescence labeling method. RESULTS: Compared with CIA group, THH at dose of 400 mg/kg significantly reduced the weight loss in type Ⅱ CIA rats (P<0.01). THH at dose of 400 mg/kg obviously decreased the contents of IL-12 by 28.31%, IL-23 by 41.57% in the serum and IL-12 by 30.78%, IL-23 by 39.46% in the foot paws, while IL-37 was significantly increased by 79.43% in the serum and 75.78% in the foot paws (P<0.01). The pathological changes of the subcutaneous tissues were improved by treating with THH (400 mg/kg). The protein expression of MMP-13 was significantly decreased by 31.82% (P<0.01), and the MMP-13 activity was also reduced. THH at dose of 200 mg/kg had no obvious improvement on the above indexes. CONCLUSION: THH has significant inhibitory effect on rat CIA by reducing the content of proinflammatory cytokines IL-12 and IL-23, increasing the content of anti-inflammatory factor IL-37, inhibiting inflammatory cell infiltration and vascular proliferation, and attenuating the protein expression of MMP-13 and MMP-13 activity in rats.

[KEY WORDS]TripterygiumhypoglaucumHutch; Rheumatoid arthritis; Matrix metalloproteinase-13; Interleukins

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是以炎性細胞浸潤，滑膜細胞增生，襯里層增厚，血管翳形成，以及軟骨和骨組織破壞為特點的一種自身免疫性疾病，最終導致關節畸形和功能喪失，但其確切發病機制目前尚未明確。最近發現基質金屬蛋白酶[1]和細胞因子網絡失衡[2]在RA發生、炎癥遷延和關節破壞中占有重要地位。昆明山海棠(TripterygiumhypoglaucumHutch，THH)是一種傳統中草藥，屬衛矛科植物，其藥理作用主要有抗炎、調節免疫和抗腫瘤等[3]，可通過抑制細胞免疫、體液免疫等多個環節對機體的免疫功能產生影響[4]，是臨床治療RA的常用藥，但其治療機制還有待進一步研究。本實驗在成功建立CIA大鼠模型的基礎上，通過檢測大鼠血清和足爪組織中IL-12、IL-23和IL-37水平和CIA大鼠足爪皮下組織中MMP-13的活性，探討昆明山海棠對CIA大鼠治療的可能機制，為臨床使用昆明山海棠治療RA提供新的理論依據和實驗數據。

材料和方法

1動物

SD大鼠50只，雌雄各半，體重180±20 g，購自鄭州大學醫學院實驗動物中心，許可證號為SCXK(豫)2012-0007。

2主要試劑

地塞米松鹽酸注射液(5 g/L)購自湖北天藥藥業股份有限公司；多聚賴氨酸、雞Ⅱ型膠原(chicken type II collagen，CII)和弗氏完全佐劑購自Sigma；冰醋酸購自北京華邁科生物技術有限公司；IL-12、IL-23和IL-37試劑盒購自北京中生瑞泰科技有限公司；兔抗大鼠MMP-13單克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH 單克隆抗體、IP細胞裂解液和ECL化學發光試劑盒均為Gibco產品；昆明山海棠購自重慶市中藥研究院制藥廠；MMP-13活性熒光檢測試劑盒購自Anaspec。

3主要方法

3.1實驗動物分組及用藥SD大鼠50只，隨機分為正常組和CIA模型組。造模方法如下：無菌條件下，雞Ⅱ型膠原15 mg溶于7.5 mL 0.1 mol/L 的醋酸中，于4 ℃過夜充分溶解。次日，與等體積弗氏完全佐劑于冰浴中充分乳化，混勻，制成穩定的乳化劑，置4 ℃冰箱保存備用。在造模組大鼠的左后肢足跖皮下注射0.1 mL乳化劑致炎，第7天在大鼠尾、背多點皮下注射0.1 mL 該膠原乳劑作為激發注射。正常對照組在同一部位同樣方法注射等劑量生理鹽水。造模后發現36只大鼠左足紅腫明顯，體積增大，說明造模成功，成功率為90%。將造模成功的36只大鼠隨機分為模型組、地塞米松治療組及昆明山海棠200 mg/kg和400 mg/kg治療組，每組9只。

昆明山海棠組大鼠于造模后第7～35天給予昆明山海棠400 mg·kg-1·d-1和200 mg·kg-1·d-1灌胃，地塞米松治療組給予0.08 mg·kg-1·d-1灌胃；正常組和模型組給予2 mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃。

3.2足腫脹度和關節指數測定用自制足容積測定儀分別于給藥前及給藥后不同時點測量各鼠左足腫脹度。

3.3CIA大鼠體重測定在致炎前及致炎后第7、14、21、28、35天分別測量各組大鼠體重。

3.4血清細胞因子水平的測定致炎后第35天，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹腔取血，并分離血清。用ELISA測定法(按試劑盒說明書進行操作)測定CIA大鼠血清IL-12 、IL-23和IL-37的含量。

3.5足爪組織中細胞因子水平測定致炎后35 d，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，迅速在左足摘取腫脹足爪，取0.3 g碾碎，放入5 mL冷生理鹽水中，于4 ℃浸泡過夜，離心，取上清。用ELISA測定法(按試劑盒說明書進行操作)測定CIA大鼠足爪組織中IL-12 、IL-23和IL-37的含量。

3.6病理切片觀察于造模第35天，取下大鼠足跖部位的組織，3%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取大鼠足跖部位的組織，用4%甲醛及時固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察足組織病理形態學改變。

3.7Western blot檢測大鼠足爪組織中基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)蛋白的表達取0.1 g大鼠左足跖部位的組織加入1 mL裂解液勻漿，12 000×g離心5 min，取上清液測蛋白濃度。將上清液與6×Loading buffer混合后，沸水浴加熱5 min，離心取上清。于4 ℃凝膠電泳，電轉移1 h至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉溶液4 ℃封閉過夜，加入兔抗大鼠MMP-13抗體(1∶1 000)室溫孵育1.5 h，PBST洗膜10 min 3次，加入HRP標記的 II抗(工作濃度1∶5 000)室溫孵育膜1 h，PBST洗膜15 min 3次。曝光底片，掃描保存為電腦文件，用Gel-Pro 4.0分析軟件將條帶的灰度值數字化。以GAPDH作內參照，目的條帶與其相比得到相對量。

3.8熒光標記法檢測大鼠足爪組織中MMP-13的活性根據MMP-13活性檢測試劑盒方法，制備足爪組織樣品勻漿液，用1 mmoL/L醋酸氨基苯汞孵育，激活原型MMP-13。繼以底物工作液(5-FAM/QXLTM520標記的FRET肽底物，分析緩沖液)孵育，用熒光酶標儀于激發波長490 nm、發射波長520 nm處測定熒光強度。以5-FAM-Pro-Leu-OH為標準品繪制標準曲線，根據標準曲線計算樣品MMP-13活性，活性單位(μmol/L)以相對5-FAM-Pro-Leu-OH的濃度表示。

4統計學處理

全部數據采用SPSS 11.8統計軟件進行分析，均以均數±標準差(mean±SD)表示，進行單因素方差分析和顯著性檢驗，方差齊時，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，方差不齊時，各組間兩兩比較采用Tamhance’s T2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1昆明山海棠對CIA大鼠一般狀況及體重的影響

實驗過程中，CIA組大鼠于造模后第7天表現為食欲下降、活動減少、皮毛無光澤，并伴有輕微脫毛、精神倦怠，體重增長緩慢，甚至減輕，消瘦明顯，與正常組大鼠相比差異顯著(P<0.01)；400 mg/kg昆明山海棠和地塞米松給藥14 d后可有效抑制CIA大鼠體重的減輕，與CIA組比較差異顯著(P<0.01)，而200 mg/kg昆明山海棠治療組與模型對照組比較無明顯效果，見表1。

表1　昆明山海棠對CIA大鼠體重的影響

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

2昆明山海棠對CIA大鼠足爪腫脹的影響

致炎數小時后，模型組大鼠關節紅腫，第7天后，踝趾關節紅腫且表面皮膚發亮充血，足墊增厚,炎癥逐漸加重，到第35天模型組大鼠活動量減少，出現負重困難。與模型組比較，昆明山海棠大鼠第2周與模型組大鼠比較無明顯差異，第3周后400 mg/kg昆明山海棠及地塞米松組大鼠體重減輕得到緩解，關節紅腫，皮膚發亮充血，趾尖出血點顏色等現象逐漸減輕 ，昆明山海棠可明顯抑制CIA大鼠足爪腫脹(P<0.01)，見表2。

表2　昆明山海棠對CIA大鼠足爪腫脹的影響

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

3昆明山海棠對CIA大鼠血清IL-12 、IL-23和IL-37的水平的影響

由表3可見，較正常組大鼠，模型組大鼠血清IL-12和IL-23含量顯著升高，分別升高了63.67%和77.96%，IL-37含量顯著降低，降低了45.73% (P<0.01)。較模型組大鼠，400 mg/kg昆明山海棠組IL-12和IL-23含量均顯著下降，分別下降了28.31%和41.57%，IL-37含量顯著升高了79.43%(P<0.01)。與模型組比較，0.08 mg/kg地塞米松組IL-12和IL-23含量亦明顯降低，分別降低了29.50%和43.05%，IL-37的含量升高了74.97%(P<0.01)。200 mg/kg昆明山海棠組與模型組相比差異不顯著(P>0.05)。

表3　昆明山海棠對CIA大鼠血清IL-12、IL-23和IL-37含量的影響

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

4昆明山海棠對CIA大鼠足爪組織中IL-12 、IL-23和IL-37水平的影響

由表4可見，較正常組大鼠，模型組大鼠足爪組織的IL-12和IL-23含量分別升高了66.39%和72.51%，IL-37含量降低了46.21%(P<0.01)。與模型組大鼠比較，400 mg/kg昆明山海棠組的IL-12和IL-23含量分別下降了30.78%和39.46%，IL-37含量則升高了75.78%(P<0.01)。與模型組比較，0.08 mg/kg地塞米松組的IL-12和IL-23含量亦分別降低了31.39%和40.72%，IL-37的含量則升高了67.60%(P<0.01)。200 mg/kg昆明山海棠組與模型組相比差異無統計學顯著性。

表4昆明山海棠對CIA大鼠足爪組織中IL-12、IL-23和IL-37水平的影響

Table 4.The effect of THH on levels of IL-12, IL-23 and IL-37 in foot claws organization of CIA rats (μg/L. Mean±SD.n=9～10)

GroupIL-12IL-23IL-37Normal198.45±30.0198.21±20.15136.54±45.01Model330.21±20.94**169.42±30.26**73.58±32.11**Dexamethasone226.56±15.48##100.43±32.08##123.32±20.23##THH(200mg/kg)302.71±11.63156.68±47.3178.40±26.08THH(400mg/kg)228.56±25.07##102.56±17.45##129.34±31.36##

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

5昆明山海棠對CIA大鼠足爪組織病理改變的影響

較正常組大鼠比較，模型組大鼠皮下組織細胞排列不規則，有嚴重的炎性細胞浸潤和血管增生現象；較模型組大鼠，400 mg/kg昆明山海棠與地塞米松組大鼠病理變化得到明顯改善，200 mg/kg昆明山海棠對改善CIA大鼠足部皮膚的病理狀況無明顯作用，見圖1。

6昆明山海棠對 CIA大鼠足爪組織中MMP-13蛋白表達的影響

Western blot分析結果顯示，模型組大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達量約為正常組的2倍；經昆明山海棠灌胃治療后，與模型組比較，400 mg/kg昆明山海棠組MMP-13表達降低了49.22%(P<0.01)，而200 mg/kg昆明山海棠組MMP-13表達基本上無變化；而經地塞米松治療后，MMP-13表達降低了46.01%(P<0.01)，見圖2。

7昆明山海棠對 CIA大鼠足爪中組織MMP-13活性的影響

由圖3可見，與正常組比較，模型組大鼠足爪組織的MMP-13活性明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，經400 mg/kg昆明山海棠治療后，大鼠足爪組織的MMP-13活性顯著降低(P<0.01)，說明400 mg/kg昆明山海棠可顯著抑制大鼠足爪組織MMP-13活性，而200 mg/kg昆明山海棠治療組大鼠足爪組織MMP-13活性無明顯變化；而經地塞米松治療后，大鼠足爪組織中MMP-13活性亦明顯降低(P<0.01)。

討論

本實驗在用Ⅱ型膠原成功建立CIA大鼠模型的基礎上，研究發現模型組大鼠逐漸出現精神倦怠、活動減少、食欲下降、體重減輕、明顯消瘦等現象；200 mg/kg昆明山海棠治療后，大鼠一般狀況與模型組比較無明顯改善，而400 mg/kg昆明山海棠治療后，與模型組比較，活動靈敏性增加，食欲明顯增強，消瘦程度明顯減輕，體重亦明顯增加，關節指數顯著下降，大鼠的精神狀況得到顯著改善，證明400 mg/kg昆明山海棠對CIA關節炎大鼠有一定的治療效果。昆明山海棠為衛矛科雷公藤屬植物，副作用較小，具有抗炎、抗腫瘤等作用[5-8]。唐瑛等[9]報道，昆明山海棠膠囊具有抗炎和免疫凋節作用，且對大鼠佐劑關節炎(adjuvant arthritis, AA)有明顯的預防和治療作用。陳森洲等[10]研究發現昆明山海棠可通過抑制膠原誘導性關節炎大鼠滑膜組織中HIF-1α表達起到治療作用；曾潤銘等[11]亦報道昆明山海棠可通過抑制類風濕關節炎滑膜細胞體外增殖和凋亡而起到治療類風濕性關節炎的作用，但有關昆明山海棠是對CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達和CIA大鼠血清及足爪組織中IL-12、IL-23和IL-37含量影響的研究未見報道。因此在此基礎上我們進一步探討昆明山海棠治療CIA的可能機制。

Figure 1.The effect of THH on paw skin pathological changes of CIA rats (×400).

圖1昆明山海棠對大鼠足爪皮膚組織病理改變的影響

Figure 2.The effect of THH on MMP-13 protein expression in foot paw tissues of CIA rats. Mean±SD.n=9～10.*P<0.05vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

圖2THH對CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達的影響

Figure 3.The effect of THH on MMP-13 activity in foot paw tissues of CIA rats. Mean±SD.n=9～10.*P<0.05vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

圖3THH對CIA大鼠足爪組織中MMP-13活性的影響

IL-12主要是由T、B淋巴細胞和單核-巨噬細胞產生一種細胞炎癥因子，可促進T淋巴細胞IFN-γ的產生，抑制IL-10、IL-11等的合成，還可直接促進B淋巴細胞增生、分化，分泌自身抗體，誘導自身免疫性疾病發生[12]。lL-23是新發現的一種炎性細胞因子，許建中等[13]報道RA患者滑膜組織中IL-23p19的mRNA、蛋白表達增高顯著。Parham等[14]亦報道，自然殺傷細胞(natural killer cells，NK細胞)作為機體重要的免疫細胞，表面有IL-23受體，IL-23通過結合NK細胞膜表面的IL-23R復合物，刺激細胞內信號轉導系統(如JAK2、sTAT3)誘導NK細胞激活，活化的NK細胞不僅可直接刺激CD4+T細胞激活分泌IL-17，也分泌TNF-α、IL-12、IL-37等多種細胞因子。

IL-37是近年來發現的IL-1細胞因子家族成員，為抗炎性細胞因子，是一基本先天性炎癥反應抑制劑，在炎癥反應和免疫應答中起抑制作用[14-16]。體外實驗證實，IL-37可以通過抑制促炎因子信號轉導通路中的STATs、c-Jun 和p38 MAPK等，從而起到抑制和削弱炎癥的作用。在健康機體中表達很少，而在炎癥患者體內呈高表達，楊超等[17]研究發現RA患者在病理狀態下，IL-37表達量明顯升高，與IFN-γ、IL-1、TNF-α和TGF-β呈正相關，且其水平與RA患者病情嚴重程度呈正相關。陳雪芳等[18]研究亦發現，IL-37在RA患者外周血漿中表達上調，而經過尼泊松治療后，其含量明顯下調。我們的實驗同樣證明，400 mg/kg昆明山海棠可明顯抑制CIA大鼠血清中促炎因子IL-12和IL-23的含量，升高抑炎因子IL-37的含量。

MMP-13是MMPs家族中的一員，又名間質膠原酶，主要降解蛋白多糖的核心蛋白和細胞外基質中的I、Ⅱ、Ⅲ 、V及Ⅺ 型膠原纖維[19]，而胞外基質中的I、Ⅱ、Ⅲ 、V及Ⅺ 型膠原纖維關節軟骨的重要組成成分，在RA發病中起著重要作用[20]。本實驗亦證實，昆明山海棠(400 mg/kg)可明顯抑制CIA大鼠足爪皮下組織中MMP-13蛋白的表達，減輕CIA大鼠足爪組織的病理改變。地塞米松與400 mg/kg昆明山海棠對CIA大鼠的治療效果都比較理想，但地塞米松為糖皮質激素類藥物，副作用比較大。而昆明山海棠藥物毒性低、避免了諸多藥物副作用。

綜上所述，本研究初步證實昆明山海棠對CIA大鼠有良好的治療作用，其機制可能與其降低CIA大鼠血清中促炎因子IL-12和IL-23的表達，升高血清中抑炎因子IL-37的含量，下調CIA大鼠足爪皮下組織中MMP-13蛋白表達，從而減輕CIA大鼠足爪組織病理改變，最終起到治療RA的效果。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)