脂聯素抑制脂肪組織MHCⅡ表達及對糖脂代謝的影響

脂聯素抑制脂肪組織MHCⅡ表達及對糖脂代謝的影響*

湯愛蓮，李燦，鄒楠，張霞△

(重慶醫科大學附屬第二醫院消化內科，重慶 400016)

[摘要]目的： 探討脂聯素是否通過影響脂肪組織主要組織相容性復合物Ⅱ類(MHCⅡ)的表達調節糖脂代謝。方法: 脂聯素基因敲除小鼠(KO)和C57BL/6小鼠 (WT)分別給予高脂飼料或普通飼料，24周后，測量小鼠體重、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、穩態胰島素評價指數(HOMA-IR)、血清甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)、血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；行肝臟組織病理形態學評價；檢測脂肪組織MHCⅡ反式激活因子(CIITA)、小鼠MHCⅡ抗原Eβ(H2-Eb1)、MHCⅡ恒定鏈(CD74) mRNA及MHCⅡ相關蛋白質表達水平。用siRNA沉默3T3-L1脂肪細胞中MHC Ⅱ的表達及用過表達載體升高3T3-L1脂肪細胞中的脂聯素和(或)MHC Ⅱ的表達，檢測脂聯素對MHC Ⅱ蛋白水平的影響。結果: 高脂飼料或普通飼料喂養的KO小鼠體重、FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、肝脂肪變性、脂肪組織中CIITA、H2-Eb1、CD74 mRNA和MHCⅡ蛋白表達水平均高于WT小鼠。在脂肪細胞中，抑制脂聯素能夠在一定程度上逆轉siRNA干擾所引起的MHCⅡ表達降低，過表達脂聯素后脂肪細胞中MHCⅡ的表達降低。結論: 脂聯素可以通過抑制脂肪組織中MHCⅡ的表達改善糖脂代謝。

[關鍵詞]脂聯素； 主要組織相容性復合物Ⅱ類； 糖脂代謝

[中圖分類號]R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.017

[文章編號]1000-4718(2015)11-2033-06

[收稿日期]2015-05-04[修回日期] 2015-07-07

[基金項目]*山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2012HL14); 濟南市青年科技明星計劃(No.20120145)

通訊作者△Tel: 0531-68616034； E-mail： liuming404@163.com

Protective effect of adiponectin on glucose and lipid metabolism by suppressing MHCⅡ expressionTANG Ai-lian, LI Can, ZOU Nan, ZHANG Xia

(DepartmentsofGastroenterologyandHepatology,TheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:sunnyzhangx@gmail.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate whether the protective effect of adiponectin on glucose and lipid metabolism is achieved through down-regulating major histocompatibility complex class Ⅱ (MHCⅡ) in the adipose tissue. METHODS: Adiponectin knockout (KO) mice and C57BL/6 (WT) mice were fed with high-fat diet and standard diet for 24 weeks, respectively. The body weight, fasting blood glucose (FBG), fasting insulin (FINS), homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), hepatic histology, and class Ⅱ trans-activator (CIITA), histocompatibility 2 class II antigen E beta (H2-Eb1) and cluster of differentiation 74 (CD74) mRNA and MHC II protein levels in adipose tissue were measured at sacrifice. siRNA targeting MHC II and overexpression vector was used in 3T3-L1 cells to explore the effect of adiponectin on the protein level of MHCⅡ. RESULTS: The levels of body weight, FBG, FINS, HOMA-IR, TC, TG, LDL-C, hepatic steatosis, CIITA, H2-Eb1 and CD74 mRNA expression, and MHCⅡ protein expression in the KO mice were higher than those in the WT mice that fed with high-fat diet or standard diet. In 3T3-L1 cells, inhibition of adiponectin reversed MHC II protein level induced by specific siRNA. The expression of MHC II in adipocytes decreased after adiponectin was overexpressed. CONCLUSION: Adiponectin improves glucose and lipid metabolism through suppressing the expression of MHCⅡ in the adipose tissue.

[KEY WORDS]Adiponectin; Major histocompatibility complex class Ⅱ; Glucose and lipid metabolism

脂肪組織不僅是能量儲存器，也是內分泌和免疫活性器官。它可分泌多種生物活性因子，其中脂肪細胞表達量最大的脂肪因子——脂聯素(adiponectin)在調節全身能量代謝和免疫/炎癥平衡中起著重要作用[1]。肥胖和胰島素抵抗患者中，循環脂聯素水平降低[2-3]。研究發現，肥胖患者脂肪細胞中主要組織相容性復合體Ⅱ類(major histocompatibility complex class Ⅱ，MHCⅡ)表達增高。通過介導脂肪組織中淋巴細胞和巨噬細胞的相互作用，MHCⅡ可以造成全身炎癥反應和胰島素抵抗。暴露于高脂飲食的MHCⅡ基因敲除小鼠比野生型小鼠有更高的胰島素敏感性和血清脂聯素水平[4]。目前研究表明，脂聯素主要通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)和腺苷酸活化蛋白激酶 (adenine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)增強脂肪酸氧化,降低循環血糖水平,提高胰島素敏感性[5-6]。而脂聯素是否可以通影響脂肪組織中MHCⅡ的表達參與調節糖脂代謝，目前尚沒有相關的研究。因此本實驗主要探討脂聯素對脂肪組織MHCⅡ表達及糖脂代謝的影響。

材料和方法

1實驗動物和細胞

10只雄性、6 周齡、體重16～20 g 的C57BL/6野生型(wild-type，WT)小鼠，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。10只雄性、6 周齡、體重16～20 g以C57BL/6為遺傳背景的基因敲除(knockout，KO)小鼠，購自上海南方模式生物研究中心。3T3-L1前脂肪細胞系購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。實驗過程中對動物的飼養和取材均遵守重慶醫科大學實驗動物管理條列和實驗動物保護的相關規定。

2主要試劑

高脂飼料(普通混合飼料86%，豬油12%，膽固醇2%)購自上海斯萊克實驗動物有限公司；胰島素放射免疫試劑盒購自北京原子高科股份有限公司；TRIzol、逆轉錄 PCR 試劑盒和PCR 擴增試劑盒均購自TaKaRa；CIITA、H2-Eb1和CD74引物由生工生物工程股份有限公司合成；脂聯素I抗購自CST；MHCⅡ和CIITA的I抗購自Abcam；β-actin的I抗和辣根酶標記山羊抗兔IgG Ⅱ抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。

3主要方法

3.1動物分組和標本取材將WT小鼠隨機分為2組：普通飼料組(NWT組)和高脂飼料組(HWT組)，將KO小鼠隨機分為2組：普通飼料組(NKO組)和高脂飼料組(HKO組)，小鼠自由進水、進食。每日觀察小鼠攝食及生長情況，每隔2周稱量小鼠體重并記錄。第24周末，小鼠禁食水12 h后稱重，摘除眼球取血并于4 000 r/min 離心15 min后分離出血清保存于-80 ℃冰箱備用，小鼠肝臟及腹腔脂肪用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

3.2肝臟組織病理形態學檢查取小鼠部分肝臟，10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規 HE 染色。光鏡下觀察肝臟組織病理形態學變化。

3.3血清學指標測定按摩小鼠尾靜脈，75%乙醇消毒，待干后采血1滴，用快速血糖儀檢測鼠尾靜脈中葡萄糖濃度。取200 μL血清于全自動放射免疫分析儀上檢測空腹胰島素(fasting insulin，FINS)，取500 μL血清于全自動生化分析儀上檢測血清甘油三酯(triglyceride，TG)、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、血清高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和血清低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

3.4實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測脂肪組織中CIITA、H2-Eb1和CD74的mRNA表達水平取80 mg脂肪組織加入液氮研磨，研至粉末狀時加入1 mL TRIzol液提取總RNA，將逆轉錄后的 cDNA 在定量PCR儀上進行實時熒光PCR反應，檢測脂肪組織MHCⅡ相關基因的表達。實驗中涉及的引物如下所示：Ciita的上游引物為5’-CCACGAGACACAGCAACCT-3’，下游引物為5’-TGCCCAGCACATACACATCT-3’；H2-Eb1的上游引物為5’-TGGACTTCAGCCAACAGGAC-3’，下游引物為5’-GGGATAAACAGCCATCAGGA-3’；Cd74的上游引物為5’-GTGCCTCAGCCCTTCTTATG-3’，下游引物為5’-GACTTCATTTGCCGTGTCCT-3’；內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的上游引物為 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物 為5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。擴增條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，39 個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。Real-time PCR 結果由CFX96 Manager Software軟件進行數據分析，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達水平。

3.5細胞分組和培養3T3-L1前脂肪細胞系用含10%胎牛血清的H-DMEM培養基于37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育。每2天更換培養液1次，細胞達約70%～80% 豐度時，傳代或用于實驗。siRNA轉染細胞分為對照組(control，Con)、siRNA沉默脂聯素組(si-Adipo)、siRNA沉默MHCⅡ組(si-MHCⅡ)及siRNA共沉默脂聯素和MHCⅡ組(si-Adipo+si-MHCⅡ)。質粒pcDNA 3.1轉染細胞分為對照組(pNC)、過表達脂聯素組(pAdipo)、過表達MHC Ⅱ組(pMHC Ⅱ)、過表達脂聯素和MHC Ⅱ組(pAdipo+pMHC Ⅱ)。

3.6siRNA合成、轉染及過表達脂聯素和MHC Ⅱ 特異性靶向脂聯素以及MHC Ⅱ的siRNA以及陰性對照siRNA，過表達脂聯素和MHC II的質粒均由銳博生物科技公司設計合成。HiPerFect轉染試劑購自QIAGEN，轉染步驟按說明書進行。

3.7Western blot法檢測脂肪組織中MHCⅡ和CIITA以及3T3-L1脂肪細胞中脂聯素和MHCⅡ的蛋白表達水平取脂肪組織和脂肪細胞加入裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA 法蛋白定量。加入電泳加樣緩沖液沸水浴中10 min，行 SDS-PAGE 電泳。電轉膜儀轉膜，將蛋白膜加入Western blot封閉液中，室溫封閉1 h；加入MHCⅡ、CIITA、脂聯素和β-actin 的 I 抗，4 ℃ 冰箱孵育過夜，洗膜 3 次，Ⅱ抗(HRP-羊抗兔 IgG)37 ℃ 孵育 1 h，ECL 顯影。

4統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0統計軟件分析，組間均數比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1小鼠肝臟組織病理形態學比較

HE染色觀察肝臟組織形態學變化，普通飼料喂養的WT和KO小鼠肝組織結構均清楚完整，肝小葉結構正常，肝細胞為多邊形排列成索狀，在中央靜脈周圍呈放射狀分布。而高脂飼料喂養的WT和KO小鼠肝小葉結構破壞，肝細胞腫大變圓，部分脂滴形成大空泡，將細胞核推擠至細胞一側，肝細胞排列紊亂，并伴大量肝細胞腫脹，部分呈氣球樣變,小葉內炎癥明顯。同給予高脂飼料的KO小鼠肝臟脂肪變性，小葉炎癥及肝細胞氣球樣變比WT小鼠更為明顯，見圖1。

Figure 1.Representative images of the liver sections (HE staining, ×200).

圖1各組小鼠肝臟組織HE染色

2小鼠體重和血清生化指標比較

24周后，高脂組KO和WT小鼠均出現明顯的肥胖、高血糖、胰島素抵抗和高脂血癥。高脂飼料或普通飼料喂養的KO小鼠體重、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平均高于WT小鼠 ，見表1。

3小鼠脂肪組織CIITA、H2-Eb1和CD74的mRNA表達水平比較

為了解KO和WT小鼠脂肪組織中MHCⅡ相關基因的變化，我們采用real-time PCR法檢測脂肪組織中CIITA、H2-Eb1和CD74 的mRNA表達水平。CIITA為調控MHCⅡ表達的關鍵分子并協調多種轉錄因子與 MHCⅡ基因啟動子。小鼠主要組織相容性基因H2-Eb1為人HLA-DRB1基因的同源基因。CD74即MHC Ⅱ恒定鏈參與MHC Ⅱ類分子的形成且與MHC Ⅱ同抗原肽的結合有關。實驗結果顯示長時間的高脂飲食導致KO和WT小鼠脂肪組織中CIITA、H2-Eb1、CD74的mRNA表達增加，且高脂飼料組KO小鼠脂肪組織中CIITA、H2-Eb1和CD74 的mRNA表達水平明顯高于WT小鼠，見圖2。

表1　各組小鼠體重和血清生化指標結果的比較

*P<0.05vsNWT group;#P<0.05vsHWT group.

Figure 2.The mRNA expression of CIITA，H2-Eb1 and CD74 in the adipose tissues. Mean±SD.n=5.*P< 0.05vsNWT group;#P<0.05vsHWT group.

圖2各組小鼠脂肪組織中CIITA、H2-Eb1和CD74的mRNA表達水平

4小鼠脂肪組織CIITA和MHCⅡ的蛋白表達水平比較

高脂組WT小鼠脂肪組織CIITA和MHCⅡ的蛋白表達水平顯著高于普通飼料組，且高脂組KO小鼠脂肪組織MHCⅡ的蛋白表達水平明顯高于WT小鼠，見圖3。

Figure 3.The protein expression of CIITA and MHCⅡ in the adipose tissues. Mean±SD.n=5.*P< 0.05vsNWT group,#P<0.05vsHWT group.

圖3各組小鼠脂肪組織中CIITA和MHCⅡ蛋白表達水平

5脂聯素抑制脂肪細胞中MHC Ⅱ的表達

為了檢測脂聯素對脂肪細胞中MHC Ⅱ表達的影響，我們用特異性靶向脂聯素的siRNA干擾細胞中脂聯素的表達。沉默3T3-L1細胞中脂聯素的表達后，MHC Ⅱ的水平明顯升高。同時，我們還篩選了一個特異性靶向MHC Ⅱ的siRNA。結果發現，沉默了3T3-L1細胞中的MHC Ⅱ后，脂聯素的水平沒有明顯改變。在3T3-L1細胞中轉染特異性沉默MHC Ⅱ的siRNA 24 h后，更換新鮮培養基，再次共轉染靶向脂聯素的siRNA，結果si-Adipo能夠在一定程度上逆轉si-MHC Ⅱ所引起的MHC Ⅱ表達下調。這些結果表明，脂聯素能夠在脂肪細胞中反向調控MHC Ⅱ的表達，見圖4。

Figure 4.The protein expression of adiponectin and MHC Ⅱ in the 3T3-L1 cells transfected with siRNA. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vssi-MHC Ⅱ group.

圖4轉染siRNA的3T3-L1脂肪細胞中脂聯素和MHCⅡ蛋白表達水平

6過表達脂聯素后脂肪細胞中MHC Ⅱ的表達降低

為了進一步確定脂聯素對脂肪細胞中MHC Ⅱ表達的影響，我們用過表達載體升高脂肪細胞中脂聯素和/或MHC Ⅱ的表達。在3T3-L1細胞中過表達脂聯素后，MHC Ⅱ的水平明顯降低；然而，過表達MHC Ⅱ后，脂聯素的水平沒有明顯改變。當我們在3T3-L1細胞中同時過表達脂聯素和MHC Ⅱ后，脂聯素過表達引起的MHC Ⅱ表達降低在一定程度上逆轉。這些結果再次表明，脂聯素能夠在脂肪細胞中反向調控MHC Ⅱ的表達，見圖5。

討論

肥胖為慢性炎癥過程，而脂肪組織的慢性炎癥在肥胖相關的胰島素抵抗的發生發展過程中起著重要的作用。相關研究表明肥胖個體脂肪組織中T淋巴細胞的數量增加、活性增強，炎癥因子IFN-γ的表達量增加[7]。IFN-γ誘導脂肪細胞MHCⅡ表達增加并介導T淋巴細胞和巨噬細胞相互作用，引起脂肪組織內巨噬細胞聚集并向炎癥表型M1極化，最終造成脂肪組織炎癥和胰島素抵抗[4]。高脂飼料喂養MHCⅡ基因敲除小鼠和野生型小鼠， MHCⅡ基因敲除小鼠肝重、肝脂肪變性、血糖、胰島素、游離脂肪酸水平均低于野生型小鼠[8]。這些提示MHC Ⅱ在肥胖引起的糖脂代謝紊亂中起著一定的作用。

Figure 5.The protein expression of adiponectin and MHC Ⅱ in the 3T3-L1 cells transfected with overexpression vectors. Mean±SD.n=5. *P<0.05vspNC group;#P<0 .05vspMHC Ⅱ group.

圖5轉染過表達載體的3T3-L1脂肪細胞中脂聯素和MHCⅡ蛋白表達水平

脂聯素是脂肪細胞分泌的具生物活性的細胞因子，占血漿總蛋白的0.01%。脂聯素自發現以來因其調節代謝、抗炎等生理作用備受關注。循環中脂聯素水平主要由遺傳因素、營養、運動和腹部脂肪決定。肥胖、代謝綜合征和心血管疾病患者血清脂聯素水平降低[9]。脂聯素通過增強脂肪酸氧化和胰島素敏感性，抑制肝臟糖異生降低循環血糖水平，提高骨骼肌胰島素敏感性來調節機體的能量代謝[10]。除參與調節新陳代謝外，脂聯素也調節免疫反應，可顯著抑制抗原特異性的T細胞增殖和巨噬細胞的吞噬活性，促使巨噬細胞向抗炎M2表型極化，減少炎癥細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的產生及誘導抗炎因子IL-10的產生[11-14]。抗炎因子IL-10調節樹突狀細胞的功能，主要表現在下調MHC Ⅱ和B7-2的表達[15]。相關研究表明脂聯素亦可調節樹突狀細胞功能使其MHC Ⅱ、IL-12 p40和CD80表達降低[16]。因而推測：脂聯素也可抑制脂肪細胞MHC Ⅱ表達，參與糖脂代謝的調節。本實驗結果顯示：高脂飼料喂養的脂聯素基因敲除小鼠同對照組小鼠相比脂肪細胞MHC II mRNA和蛋白表達水平、血糖、血脂、肝脂肪變性、胰島素抵抗均明顯增加。而且，在脂肪細胞中，沉默脂聯素的表達可以顯著升高細胞中MHC Ⅱ的蛋白水平。然而，MHC Ⅱ的蛋白表達被干擾掉后，脂肪細胞中脂聯素的水平沒有改變。這一結果提示脂聯素可以反向調控MHC Ⅱ的蛋白表達。當細胞中MHC Ⅱ的蛋白被干擾24 h后，重新沉默脂聯素的表達，能夠明顯導致MHC Ⅱ蛋白水平的再次升高。過表表達脂肪細胞中的脂聯素后，MHC Ⅱ的水平明顯降低，但過表達MHCⅡ后，脂聯素的水平并沒有明顯改變;同時過表達脂聯素和MHC Ⅱ后，脂聯素過表達引起的MHC Ⅱ表達降低能在一定程度上得到逆轉。這些結果均證實，脂聯素能夠有效抑制MHC Ⅱ的表達。

本研究提示脂聯素抑制脂肪組織MHC Ⅱ表達，并改善糖脂代謝，為脂聯素治療肥胖等代謝相關的疾病提供了新的理論依據。但其作用機制還需要進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)