窯歸多糖對小鼠急性肝損傷的保護作用

窯歸多糖對小鼠急性肝損傷的保護作用

王振富鐘靈1楊付明

(湖北民族學院醫學院，湖北恩施445000)

摘要〔〕目的探討窯歸多糖對小鼠急性肝損傷的保護作用及其機制。方法復制四氯化碳(CCl4)急性肝損傷小鼠模型，將昆明種小鼠50只隨機分為5組(n=10)，即正常對照組、模型組、聯苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組。窯歸多糖低劑量組和高劑量組行窯歸多糖灌胃21 d，除正常對照組，其余各組腹腔注射CCl4，24 h后測定小鼠血清中乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST) 、谷丙轉氨酶(ALT)及肝臟指數，測定肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。測定小鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-2、IL-10的含量。結果與正常對照組比較，模型組小鼠LDH、AST、ALT 及肝臟指數明顯升高，SOD和GSH-Px的活性降低，MDA含量明顯增加，TNF-α和 IL-2明顯升高、IL-10明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，窯歸多糖低劑量組和高劑量組小鼠LDH、AST、ALT及肝臟指數明顯降低，SOD和GSH-Px的活性增強，MDA含量明顯減少，TNF-α和 IL-2明顯降低、IL-10明顯升高(P<0.05，P<0.01)。結論窯歸多糖對小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用。

關鍵詞〔〕窯歸多糖；四氯化碳；肝損傷；炎性因子；抗氧化酶

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家中醫藥管理局公共衛生專項資金項目(財社[2010]91號)

1湖北民族學院附屬民大醫院

第一作者：王振富(1965-)，男，副教授，主要從事中藥藥理學研究。

當歸是傘形科植物當歸Angelica sinensis(oliv.)Diels的干燥根，具有多種藥理學效應，如補血活血、調經止痛、潤腸通便、生肌腱骨之功效；用于血虛萎黃、眩暈心悸、月經不調、經閉痛經、虛寒腹痛、腸燥便秘、風濕痹痛、跌撲損傷等〔1〕。當歸對人體呼吸、循環、血液及免疫系統均有作用，此外還有抗腫瘤作用，其主要活性成分為多糖、阿魏酸、揮發油、黃酮類等。窯歸是恩施石窯產當歸的習稱，其質量優良，為南方常用當歸品種。多糖是一類存在于百余種植物中，具有廣泛生物活性的大分子物質，其生理活性強，細胞毒性低，毒副作用小，因此對植物多糖的研究已成為熱點。有研究表明，歸芪多糖具有一定的抗氧化、抗病毒、延緩衰老和保護肝損傷的作用〔2，3〕。本研究以四氯化碳(CCl4)誘導急性肝損傷小鼠模型實驗，觀察窯歸多糖在保護肝損傷方面的作用。

1材料與方法

1.1主要試劑和藥品CCl4(天津市四通化工廠)，聯苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒(華美生工)； 腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-2和IL-10試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)。

1.2主要儀器全自動生化分析儀(日本Olympus Au400)，雙目顯微鏡(日本Olympus ABX41)，756型紫外分光光度計(上海分析儀器總廠),BE-5286A型旋轉蒸發儀(上海雅榮生化設備儀器有限公司)，ULTRA-TURRAX378型組織勻漿機(東莞市通用精工液壓機械工具廠)，MK3型酶標儀(成都一科儀器設備有限公司) 。

1.3動物昆明種小鼠，雌雄各半，體重20～25 g(由湖北省實驗動物中心提供)。

1.4實驗方法

1.4.1窯歸多糖提取〔4〕窯歸(湖北恩施石窯)，干燥，粉碎過篩，取當歸粉末25 g，石油醚回流提取1.5 h，濾過，棄去濾液，濾渣用80%乙醇回流提取1.5 h，濾過，棄去濾液，濾渣用蒸餾水提取3次，每次1.5 h，合并3次濾液，濾液濃縮至100 ml，加95%乙醇使含醇量達80%，低溫(4℃左右)放置24 h，即析出粗多糖。用Sevage法對粗多糖進行脫蛋白，直至260 nm和280 nm處無明顯吸光為止，收集上清液，用0.2%活性碳脫色2次，干燥，得窯歸多糖，稱重。

1.4.2動物分組、處理及模型的建立〔5〕將昆明種小鼠50只隨機分為5組(n=10)，即正常對照組、模型組、聯苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組。窯歸多糖低劑量組和高劑量組分別以100、200 mg/kg；聯苯雙酯組以200 mg/kg，正常對照組和模型組以等量生理鹽水灌胃。照常飲水喂食，持續21 d，于第21天給藥1 h后，除正常對照組腹腔注射等量生理鹽水外，其余各組腹腔注射0.08%(用花生油配制)CCl4(0.1 ml/10 g)。18 h后摘眼球取血，分離血清待測。摘取肝臟，生理鹽水漂洗，濾紙拭干后稱重，按1∶9加入預冷的生理鹽水，勻漿(4℃，2 500 r/min 30 min)，上清即為10%肝組織均漿液，-40℃保存待測。

1.4.3測定指標和方法用全自動生化分析儀(Olympus Au400)測LDH、AST、ALT；用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測TNF-α、IL-2和IL-10；以鄰苯三酚法測SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH-Px，硫代巴比妥酸顯色法(TBA)測MDA含量。

1.5統計學方法采用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1窯歸多糖對小鼠LDH、ALT、AST及肝臟指數的影響與正常對照組比較，模型組小鼠LDH、ALT、AST及肝臟指數顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，聯苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組小鼠LDH、ALT、AST及肝臟指數明顯降低(P<0.01)，見表1。

2.2窯歸多糖對小鼠SOD、GSH-Px及MDA的影響與正常對照組比較，模型組小鼠SOD和GSH-Px活性明顯降低，MDA含量明顯增高(P<0.01)，與模型組比較，聯苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組小鼠SOD和GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

2.3窯歸多糖對小鼠TNF-α、IL-2及IL-10的影響與正常對照組比較，模型組小鼠TNF-α和IL-2的含量明顯升高，而IL-10的含量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，聯苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組小鼠TNF-α和IL-2的含量明顯減少，而IL-10的含量明顯升高(P<0.01)，見表2。

組別LDH(U/L)ALT(U/L)AST(U/L)肝臟指數(mg/g)正常對照組112.32±13.8122.40±3.6740.31±19.3546.30±1.45模型組2132.83±71.481)114.22±17.201)183.45±23.361)54.13±1.651)窯歸多糖低劑量組369.67±12.312)63.93±8.472)88.45±8.932)50.27±2.472)窯歸多糖高劑量組316.72±13.262)43.34±4.402)64.35±7.192)49.53±1.862)聯苯雙酯組328.59±12.252)31.321±4.362)49.32±4.402)47.40±1.682)

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

組別MAD(nmol/ml)SOD(U/L)GSH-Px(U/L)TNF-α(mg/L)IL-2(mg/L)IL-10(mg/L)正常對照組12.48±1.35459.45±43.1098.32±18.3629.91±1.2616.78±0.5663.37±1.53模型組25.55±2.901)325.75±22.931)46.38±19.261)49.68±0.601)49.60±0.621)56.53±1.171)窯歸多糖低劑量組21.78±2.002)370.20±24.712)79.67±15.102)42.10±1.363)42.03±1.373)67.14±2.473)窯歸多糖高劑量17.54±1.303)413.80±28.833)86.45±14.603)41.78±3.103)40.31±0.803)72.02±3.303)聯苯雙酯組15.50±1.483)434.65±32.503)92.56±18.773)39.64±2.313)42.25±1.493)71.21±1.463)

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

各種有害因素導致的肝臟損傷，其表現為脂肪肝、膽汁淤積、肝細胞纖維化、肝細胞壞死、肝硬化及肝癌等。目前，對肝損傷的防治仍然是一大難題。CCl4引起肝損傷，在形態及病理生理方面與人的慢性肝病較為相似〔6，7〕。研究表明，楤木葉總皂苷保護肝損傷作用機制是通過肝細胞內酶系統的誘導作用，從而使肝細胞的核酸、蛋白質、糖原的合成及能量的合成增加，保護肝細胞膜的正常結構而起到保護肝損傷的作用〔7〕。有報道枸杞多糖、黃芪多糖等對CCl4引起的肝損傷有保護作用〔8，9〕。本實驗結果說明機體抗氧化酶活性降低，清除自由基的能力下降，過氧化脂質的代謝產物MDA堆積，進一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質交聯，生成無活性的脂褐質，沉積于組織細胞，破壞細胞膜結構，導致細胞內的轉氨酶(如AST、ALT)等釋放入血液，最終導致細胞無法維持正常代謝而死亡〔10〕。窯歸多糖能明顯改善上述指標，表明窯歸多糖一方面可通過提高機體抗氧化酶的活性，或直接清除機體過多的自由基而發揮其保護肝的作用。CCl4引起小鼠TNF-α和 IL-2明顯升高、IL-10明顯降低，說明炎性因子(TNF-α、IL-2)的產生和釋放，抑炎因子(IL-10)降低引起了明顯炎癥反應。窯歸多糖能明顯改善上述指標，表明窯歸多糖另一方面可通過下調炎性因子和上調抑炎因子而達到保護肝的作用，但其確切機制還需進一步研究。

4參考文獻

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9牛春紅，劉斌焰，邢雁霞，等.黃芪多糖對四氯化碳肝損傷保護作用的影響〔J〕 .中國醫學工程，2012；20(3)：38-9.

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〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)