米諾環素對大鼠脊髓擠壓傷后運動功能恢復的影響

米諾環素對大鼠脊髓擠壓傷后運動功能恢復的影響

鄭州大學基礎醫學院鄭州450000

【摘要】目的探討米諾環素對大鼠脊髓擠壓傷后運動功能恢復的影響。方法成年Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，分為空白對照組：只打開脊柱椎板，不損傷脊髓；米諾環素治療組：制作脊髓擠壓傷模型，腹腔注射米諾環素；鹽水對照組：制作脊髓擠壓傷模型，腹腔注射等劑量的生理鹽水。于脊髓擠壓傷后第3天取大鼠脊髓標本，進行組織水腫、損傷面積的測量，并行組織切片，進行細胞凋亡Caspase-3染色，觀察細胞凋亡情況。同時于各個時間點進行大鼠后肢運動功能評分(basso-beattie-bresnahan，BBB評分)。結果與生理鹽水組比較，米諾環素治療組損傷面積更小，細胞凋亡數量更少，組織水腫更輕，運動功能恢復更好。結論米諾環素可以促進大鼠脊髓擠壓傷后運動功能的恢復。

【關鍵詞】脊髓擠壓傷；米諾環素；細胞凋亡；組織水腫；損傷面積

通訊作者倉寶成李付廣()

【中圖分類號】R-332

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)致殘率極高，常導致患者運動、感覺功能喪失。脊髓損傷后的病理生理演變包括原發性損傷和繼發性損傷，其中多種因素參與繼發性損傷：包括水腫、自由基、炎癥反應、興奮性毒性等[1]。繼發性損傷一直是神經科學研究的重點。米諾環素是一種廣譜抗菌的四環素類抗生素，研究報道米諾環素還具有抑制炎癥反應、抗凋亡、調節代謝等方面的作用[2]。本實驗采用大鼠T8-9節段脊髓擠壓傷模型，通過腹腔早期給予米諾環素，探討米諾環素對大鼠脊髓擠壓傷的修復作用。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組SD雄性大鼠36只，由鄭州大學實驗動物中心提供，體質量200～220 g。將動物分為假手術組、鹽水對照組和米諾環素治療組，每組12只。假手術組：僅進行椎板去除術；鹽水對照組：脊髓擠壓傷后，定時行腹腔注射鹽水對照；米諾環素治療組：脊髓擠壓傷后，定時行米諾環素腹腔注射治療。各組動物于術后0、1、3、5、7 d進行運動功能評分。本實驗的所有操作符合153醫院動物實驗倫理委員會的要求。

1.2模型制作脊髓擠壓傷模型：大鼠用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，背部剃毛，以T8棘突為中心，切開皮膚3～4 cm，分離皮下及椎旁肌，暴露T7-9的椎板和棘突，于體視顯微鏡(Olympus ZX-16 s)下用咬骨鉗小心咬除T8節段的棘突和椎板，暴露T8脊髓并保持硬脊膜完整。用特制的鑷尖間距0.5 mm的夾力恒定的鑷子小心插入脊髓兩側間隙中夾住脊髓20 s(假手術對照組僅行T8錐板去除術)，縫合肌肉和皮膚，碘伏消毒傷口。術后每日人工輔助排尿2 次，排除傷口或尿路感染的動物。

1.3給藥劑量及途徑米諾環素(Sigma 公司)用無菌鹽水配制成45 mg/ mL濃度，于脊髓擠壓傷術后0 h、12 h、1 d、2 d、3 d按照45 mg/kg的劑量每天腹腔注射1次。鹽水對照組在同樣的時間點腹腔注射等同體積的滅菌生理鹽水。

1.4組織準備各組動物于相應時間點取材，假手術組于椎板去除術后1 d取材。大鼠在給予過量的1%戊巴比妥鈉麻醉后，開胸行左心室灌注，先灌注100 mL生理鹽水沖洗體循環內的血液，然后灌注用0.1 mol/L磷酸緩沖液配置的4%多聚甲醛400 mL固定組織，取出以損傷為中心的2 cm脊髓組織，將組織置于25%蔗糖中脫水，直至標本沉底。行連續矢狀冰凍切片,切片厚度為20 μm,分貼成10套。

1.5組織學染色選取1套組織標本切片，HE染色，觀察損傷面積；另選取1套組織標本切片，室溫晾干，PBS洗3次，行Caspase-3一抗(1∶200 Abcam)孵育，室溫過夜，PBS洗片3次，加入二抗(1∶1000 Molecular Probes)室溫孵育2 h，50%甘油封固。熒光顯微鏡(BX50 Olympus)觀察、照片以統計。

1.6脊髓水腫將大鼠用1%戊巴比妥鈉過量麻醉后，左心室灌注生理鹽水100 mL，去除椎板，取以損傷部位為中心1 cm長的脊髓組織，稱重后經80 ℃烘箱12 h，再次稱重，分析干濕質量比。

1.7BBB評分按照BBB評分系統標準，采用雙盲法，于術后各時間點對大鼠后肢運動功能進行評分。

2結果

2.1脊髓組織水腫假手術組脊髓組織干濕質量比為0.42±0.003；脊髓擠壓傷后鹽水治療組3 d的干濕質量比為0.31±0.008；而脊髓擠壓傷后米諾環素治療組3 d的干濕質量比為0.35±0.007。與鹽水治療組相比，米諾環素治療組的水腫程度在第3天明顯減輕(P< 0.05)。見圖1。

注：與鹽水組比較，米諾環素組的組織水腫更輕，*P<0.05

圖1脊髓擠壓傷后3 d脊髓組織干濕質量比

2.2HE染色結果研究報道，脊髓擠壓傷后，第3天時損傷面積最大[3]；由此我們取脊髓擠壓傷后3 d的組織切片，進行HE染色，結果顯示：米諾環素治療組損傷面積明顯小于鹽水對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2脊髓擠壓傷后3 d損傷面積a：假手術組；b：鹽水治療組；c：米諾環素治療組；d：損傷面積統計圖；bar=500 μm，*P<0.05

2.3細胞凋亡情況將脊髓擠壓傷后3 d和7 d的組織切片進行Caspase-3染色，結果顯示：假手術組Caspase-3陽性細胞很少，米諾環素治療組Caspase-3陽性細胞數明顯少于鹽水治療組，說明米諾環素可以減少細胞凋亡。見圖3。

圖3脊髓擠壓傷后3 d Caspase-3染色結果a：假手術組；b：鹽水治療組；c：米諾環素治療組；d：Caspase-3陽性細胞數統計圖；bar=50 μm，*P<0.05

2.4BBB評分按照BBB評分細則對實驗動物于各時間點進行評分，假手術組動物運動功能未受影響；米諾環素治療組和鹽水對照組于擠壓傷后0、1和3 d無明顯差異(P>0.05)，于傷后5、7 d可見，米諾環素組運動功能明顯好于鹽水對照組(P<0.05)。見圖4。

圖4　脊髓擠壓傷后不同時間點BBB評分

3討論

脊髓損傷后，米諾環素是一種半合成的四環素類藥物，最近的研究發現，其在炎癥反應、血管新生、細胞凋亡等方面起重要作用；馮曉波等[4]報道，米諾環素可通過減少膠質瘢

痕的形成，促進脊髓不完全損傷后的運動功能恢復；段冰玉等[5]研究報道，米諾環素可以促進神經保護性因子BDNF、NT-3的表達，進而對神經起保護作用。本實驗采用脊髓擠壓傷模型，通過檢測脊髓損傷后的水腫程度、細胞凋亡、損傷面積方面，確定米諾環素可以減輕組織水腫、減少細胞凋亡、減小損傷面積，進而促進大鼠脊髓擠壓傷后運動功能恢復。

綜上所述，本文為米諾環素對脊髓擠壓傷的保護機制提供了進一步的依據，為臨床應用提供了基礎。

參考文獻4

[1]Oyinbo CA.Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury:a nugget of this multiply cascade[J].Acta Neurobiol Exp (Wars),2011,71(2):281-299.

[2]Takeda M,Kawaguchi M,Kumatoriya T,et al.Effects of minocycline on hind-limb motor function and gray and white matter injury after spinal cord ischemia in rats[J].Spine,2011,36(23):1 919-1 924.

[3]劉愛剛,趙杰,王聰,等.大劑量甲基強的松龍對大鼠急性脊髓半切損傷的早期神經保護作用[J].脊柱外科雜志,2010,8(4):219-223.

[4]馮曉波,任航空,楊述華.米諾環素對不完全脊髓損傷大鼠神經功能修復的影響[J].中國醫院藥學雜志,2012,32(10):744-747.

[5]段冰玉,周厚綸,任航空.米諾環素對不完全脊髓損傷大鼠脊髓BDNF和NT-3表達的影響[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2013,22(5):406-410

(收稿2014-11-08)