中藥復方“益腎固沖湯”對人乳腺癌細胞株MCF-7增殖及凋亡的影響

中藥復方“益腎固沖湯”對人乳腺癌細胞株MCF-7增殖及凋亡的影響

白羽臧學麗1張超2崔桂花李文亮薛瑩雪肖蕭徐廣宇3閆魏魏4

(吉林醫藥學院藥學院，吉林吉林132001)

摘要〔〕目的探討益腎固沖湯抑制乳腺癌細胞增殖，促進其凋亡的作用和抗癌分子的機制。方法體外培養人乳腺細胞株(MCF)-7細胞利用MTT法觀察益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用，用流式細胞儀檢測益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7凋亡及細胞周期的影響。結果益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖具有抑制作用，都具有明顯的時-效和量-效關系。人乳腺癌細胞MCF-7細胞經過不同濃度的益腎固沖湯處理24、48、72 h后，各組均呈現不同程度的凋亡，且凋亡率隨著計量的增加、時間的延長而逐漸增加。益腎固沖湯在40 μg/ml量、作用72 h時具有統計學差異，細胞凋亡率最高，達17.93%，與正常對照組相比，G0/G1期細胞比率隨作用時間延長在逐漸減少，G2/M期的細胞比率隨作用時間延長在逐漸增加，細胞生長周期較明顯停滯在G2/M期，具有明顯時間依賴性。結論益腎固沖湯可以抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖，誘導細胞凋亡，具有明顯的量效和時效關系。細胞的增殖抑制與誘導凋亡作用與G2/M期有關。

關鍵詞〔〕益腎固沖湯；乳腺癌；人乳腺癌細胞株；抑制增殖；細胞凋亡

中圖分類號〔〕R73〔

基金項目：吳階平基金(No.320.6750.13229)，吳階平基金(No.320.6750.13216)，吉林教育廳“十二五”科學技術研究課題(No.〔2014〕505)

通訊作者：閆魏魏 (1989-)，男，碩士，主要從事急慢性腹痛的診斷與治療研究。

1長春高等醫學專科2吉林大學基礎醫學院

3北華大學藥學院4吉林大學第一附屬醫院

第一作者：白羽(1980-)，女，講師，博士，主要從事中藥成分分析研究。

目前臨床常用的治療乳腺癌主要有內分泌治療、放射治療、化療、誘導分化治療等。但是，幾乎都存在作用靶點單一，療效不盡人意，毒副作用大等缺點。我國傳統的中藥復方，有望成為突破這些瓶頸輔助的利器。本實驗選用中藥復方“益腎固沖湯”對激素依賴性腫瘤乳腺癌激素受體的人乳腺癌細胞株(MCF-7)雌激素受體(ER+)進行研究。通過研究復方在生理劑量環境及藥理劑量環境下對MCF-7細胞增殖及凋亡的影響，為中藥在乳腺癌的輔助治療中的安全性和有效性提供實驗室依據及理論基礎。

1材料與方法

1.1實驗藥物MCF-7由南京凱基生物科技發展有限公司提供，完全培養基為90%RPMI-1640+10%胎牛血清(FBS)，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。益腎固沖湯，購買于吉林大藥房。青霉素、鏈霉素混合液，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，RPMI-1640(美國GIBCO)，二甲基亞砜(DMSO)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Amresco)，膜聯蛋白V熒光素(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)。

1.2主要試劑與耗材超凈工作臺，CO2培養箱，臺式低速離心機，酶標儀，生物倒置熒光顯微鏡，流式細胞儀(美國FACS Calibur Becton-Dickinson)。

1.3方法

1.3.1(MTT)法觀察益腎固沖湯對MCF-7細胞增殖抑制作用取對數生長期MCF-7細胞，經消化、計數、配制成濃度為5×104個/ml的細胞懸液，96孔細胞培養板中每孔加入100 μl細胞培養懸液(每孔5×103個細胞)，將細胞培養板置于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h。棄去培養基，磷酸緩沖液清洗2次，用完全培養基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入200 μl相應含藥培養基，同時設立陰性對照組，陽性對照組(加入不同濃度的益腎固沖湯2×10-1、2×10-2、2×10-3、2×10-4、2×10-5g/ml)。96孔細胞培養板置于37℃，5%CO2培養箱中培養24、48、72 h。將96孔板進行MTT染色，λ=490 nm，測定OD值。計數各組別抑制率及藥物IC50。實驗組抑制率(%)=(陰性對照組OD值-實驗組OD值)/陰性對照組OD值×100%。應用SPSS17.0通過機率單位加權回歸法計算IC50。

1.3.2流式細胞儀檢測益腎固腎湯對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響隨機分為空白對照組(不加藥物組)、益腎固沖湯用藥組(每孔加入低濃度2.5 μg/ml、中濃度10 μg/ml和高濃度40 μg/ml，用0.2%DMSO溶解)。孵育時間為24、48、72 h。之后對細胞進行細胞復蘇、培養、傳代。流式細胞儀(Annexin V/PI雙染色法)檢測益腎固沖湯對MCF-7細胞凋亡的影響。

1.3.3流式細胞儀檢測益腎固沖湯對MCF-7細胞凋亡周期的影響隨機分為陰性對照組(不加藥物組)、益腎固沖湯用藥組(每孔加入低濃度2.5 μg/ml、中濃度10 μg/ml和高濃度40 μg/ml，用0.2%DMSO溶解)。孵育時間為24、48、72 h。對細胞進行細胞復蘇、培養、傳代。將對數生長期的MCF-7細胞消化接種到六孔板中，次日，待細胞貼壁后，根據組別設置加入相應的含藥培養基，同時設立陰性對照組。作用24、48、72 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細胞。用磷酸緩沖液洗滌細胞一次(離心2 000 r/min，5 min)收集5×105細胞。制備的單細胞懸液用體積分數為70%乙醇固定2 h，4℃保存，染色前用磷酸緩沖液洗去固定液(細胞懸液用200目篩網過濾一次)。加100 μl RNaseA37℃水浴30 min。再加入400 μl碘化丙啶(PI)染色混勻，4℃避光30 min。上機檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。

2結果

2.1益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響隨益腎固沖湯濃度的增高及用藥時間的延長，對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制的作用逐漸增強。與陰性對照組相比，除劑量為2×10-5g/ml，作用時間24 h組無統計學意義外，其余各組均有統計學意義(P<0.05)。可見益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖起到抑制作用，且具有明顯的量效與時效關系。見表1。

組別(μg/ml)24hOD值(x±s)抑制率(%)48hOD值(x±s)抑制率(%)72hOD值(x±s)抑制率(%)對照組0.322±0.23122.350.362±0.0091)45.30.242±0.00673.42×10-5g/ml0.342±0.0163.850.591±0.0081)7.160.734±0.0111)20.682×10-4g/ml0.354±0.0071)9.750.576±0.0111)15.350.724±0.0121)33.282×10-3g/ml0.341±0.0101)13.790.563±0.0081)22.440.513±0.0071)41.342×10-2g/ml0.347±0.0091)16.130.492±0.0051)27.910.389±0.0051)54.622×10-1g/ml0.336±0.0041)18.690.459±0.0061)31.590.321±0.0101)66.21

與對照組比較：1)P<0.05

2.2益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響人乳腺癌MCF-7細胞經過不同濃度的益腎固沖湯處理24、24、72 h后，各組均呈現不同程度的凋亡，尤其中晚期細胞的凋亡趨勢明顯，總凋亡率隨著劑量的增加、時間的延長而逐漸增高。在益腎固沖湯40 μg/ml、作用72 h后，誘導細胞凋亡能力最強，總凋亡率為73.5%。見圖1。

圖1　不同劑量益腎固沖湯作用24、48、72 h人乳腺癌 MCF-7細胞的總凋亡率

2.3益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖周期的影響見表2。低、中、高濃度益腎固沖湯作用于人乳腺癌MCF-7細胞

表2益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖周期的影響(%)

時間組別G1SG2凋亡率24h陰性對照組54.626.7518.650秋水仙素2.5μg/ml54.1228.8916.990秋水仙素10μg/ml51.2327.8620.911.54秋水仙素40μg/ml47.8826.7925.333.9248h陰性對照組51.3530.3218.330秋水仙素2.5μg/ml46.3829.7823.845.11秋水仙素10μg/ml44.6928.4526.867.32秋水仙素40μg/ml43.5227.1629.327.0472h陰性對照組54.5927.9117.50秋水仙素2.5μg/ml44.6527.1328.225.35秋水仙素10μg/ml42.3925.9731.646.24秋水仙素40μg/ml34.6427.6137.7517.93

24、48、72 h后，以陰性對照組相比，G0/G1期細胞比率隨作用時間延長、濃度的增加在逐漸減少；S期細胞比例基本不變；G2/M期的細胞比率隨作用時間延長、濃度的增加在逐漸增多，細胞生長周期較明顯的停滯在G2/M期，細胞G2/M期堆積，具有明顯時間依賴性，益腎固沖湯40 μg/ml，作用72 h時，MCF-7細胞凋亡率最高，達17.93%。

3討論

乳腺癌是一個世界范圍內嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，其中老年乳腺癌的特點為臨床分期晚、病理分級高、淋巴結轉移多〔1〕。然而目前的乳腺癌治療方案幾乎都存在作用靶點單一，療效不盡人意，毒副作用大等缺點，這些成為臨床腫瘤治療的瓶頸。我國傳統的中藥復方，有望成為突破這些瓶頸輔助的利器。采用中藥復方對老年乳腺癌進行聯合治療，已被臨床證明行之有效〔2，3〕。其機制在于中醫強調從整體出發，調整機體陰陽、氣血、臟腑功能的平衡，內治和外治相結合，根據不同的臨床證候，采用辨證論治。事實表明，中醫藥能促進老年乳腺癌患者術后體質的恢復；減輕乳腺癌放化療等輔助治療所致的毒副反應；不同程度地緩解晚期乳腺癌患者的臨床癥狀。這對改善患者的生存質量，提高生存率，降低復發率，都具有重要的臨床意義和廣泛的應用前景。

中醫認為乳腺癌的主要病因和發病機制在于：肝氣郁結、沖任失調、毒熱蘊結、氣血兩虛。肝氣郁結，肝經失于疏泄，氣血奎滯，乳絡不暢，則乳房結塊；先天不足，或多產房勞，肝腎虧虛，沖任失養，致乳絡不榮，則乳房腫塊質硬；氣火痰熱，結聚肝胃二經，經脈疲滯，化生乳巖，毒熱蘊結，致腫塊破潰，則浸淫穢臭；乳巖日久，氣血耗傷，則貧血消瘦，疼痛難忍，五臟俱衰。根據乳腺癌的臨床演變及特點，中醫專家認為其治療上應以清熱滋陰，補益肝腎為主。益腎固沖湯是依據中醫傳統理論組建的中藥復方，由菟絲子、覆盆子、杜仲、川斷、桑寄生、熟地、白芍、阿膠、黨參、陳皮、甘草等11味中藥組成。此方在臨床進行了基于病癥的療效觀察，表明其能夠明顯增加乳腺癌病人的5年存活率。

本實驗顯示益腎固沖湯對MCF-7細胞增殖具有抑制作用，都具有明顯的時-效和量-效關系。通過益腎固沖湯對MCF-7細胞增殖影響的研究，發現益腎固沖湯對MCF-7有明顯的抑制作用，為中藥治療乳腺癌奠定了理論依據。

中藥能通過多種方式干擾腫瘤的生長、代謝、增殖等過程。通過流式細胞儀儀檢測益腎固沖湯對MCF-7細胞的凋亡作用。結果顯示益腎固沖湯能阻滯細胞周期，對DNA合成有抑制作用，對誘導細胞凋亡具有明顯的量效、時效關系。且MCF-7細胞中晚期凋亡趨勢明顯。因此益腎固沖湯具有較好的抗腫瘤活性。

在益腎固沖湯對MCF-7細胞增殖周期的影響的實驗中與陰性對照組相比，G0/G1期細胞比率隨作用時間延長、濃度的增加在逐漸減少；S期細胞比例基本不變；G2/M期的細胞比率隨作用時間延長、濃度的增加在逐漸增多，細胞生長周期較明顯的停滯在G2/M期，細胞G2/M期堆積，具有明顯時間依賴性。

綜上所述，益腎固沖湯可以抑制MCF-7細胞的增殖，誘導細胞凋亡，具有明顯的量效和時效關系，細胞的增殖抑制與誘導凋亡作用與G2/M期有關。

4參考文獻

1隗立兵，康驊，海濤，等.老年乳腺癌 140 例的臨床特點和治療〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(15)：2858-60.

2孫燕.臨床腫瘤內科手冊〔M〕.第4版.北京：人民衛生出版社，2003：586-97.

3鄒慶華，姜玉石，李凱.胸苷磷酸化酶的研究進展及其化療效果間的關系〔J〕.中國腫瘤臨床，2005;32(9)：535-53.

〔2013-09-13修回〕

(編輯袁左鳴)