大鼠腦室出血后腦干藍斑內去甲腎上腺素能神經元表達變化的研究

吳 勇 譚 華 李小剛（通訊作者）

瀘州醫學院附屬醫院神經內科 瀘州 646000

腦室出血分為原發性和繼發性兩大類，以后者常見。既往研究發現，腦出血后腦組織中NE含量增高，因此，推測腦室出血中NE含量也可能會增高，并加劇了對腦組織及其他器官的損害，加重病情。本實驗通過制作大鼠PIVH模型觀察腦干組織藍斑內去甲腎上腺素能神經元的表達變化及對腦水腫、神經行為學評分的影響，進一步探討NE在IVH損傷中的作用，為臨床診斷治療、預測病情提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 健康雄性SD大鼠60只，體質量（300±20）g（由重慶醫科大學動物科提供），免疫組化觀察藍斑去甲腎上腺素能神經元。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及動物模型建立：實驗動物隨機分為正常組、假手術組、腦室出血組。參照彭建偉等［1］方法制備PIVH模型。按照Paxinos和Watson［2］《大鼠腦立體定位圖譜》確定右側側腦室位于Bregma點后0.8mm，旁開1.5 mm，立體定向儀定位后用骨鉆鉆一直徑約1mm小孔，深達硬腦膜表面即可。用微量進樣器從左側股動脈抽取40μL動脈血，25℃恒溫水浴箱1～3min使血液稍黏稠，然后固定進樣器在立體定位儀上，沿鉆孔緩慢進針4.5mm（此處為側腦室位置）以10μL／min速度將血注入腦室內，留針10min，然后緩慢退針（30s），縫合頭皮。假手術組大鼠只切開頭皮和顱骨鉆孔。手術過程嚴格無菌操作。整個實驗過程保持室溫26℃。術后不同時間點6h、1d、3d、5d、7d大鼠斷頭處死。

1.2.2 觀察指標：Hua等［3］的觸須誘發前肢放置試驗法觀察IVH后大鼠的神經行為變化，具體如下：檢查者手持大鼠背部皮膚使其四肢懸空，將胡須刷觸桌面角邊緣，測試同側前肢的活動情況，未受損者可將前肢迅速放到桌面，腦損傷時此動作有不同程度的損害，大鼠每側受測10次，前肢觸及桌面角邊緣次數的百分率即為該得分。該方法能夠較敏感反映中樞神經系統損傷的感覺與運動功能障礙。（1）腦組織含水量測定：于實驗各相應時間點終止觀察，2%戊巴比妥鈉深度麻醉動物，迅速斷頭，開顱取出腦組織，去除腦膜、低位腦干和小腦，先用電子天平稱濕質量，后置于電熱恒溫烤箱，恒溫100℃烘烤24h再稱量獲得干質量，按Elliott公式計算腦組織含水量：含水量＝（濕質量-干質量）／濕質量×100%。（2）腦干藍斑內DBH神經元DBH陽性細胞計數：采用多巴胺-β-羥化酶（DBH）免疫組化染色。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計分析軟件進行數據分析，計量資料用±s表示，各組比較均采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的多個樣本均數的兩兩比較法（LSD法），變量之間采用相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

見表1～3。分別為各組大鼠不同實時間點籃板內去甲腎上腺素能神經元細胞熟練、神經行為學評分和腦組織含水量的比較結果。可見IVH組藍斑內出現大量深染的DBH陽性神經元，形態與正常組、假手術組相似，染色加深，陽性細胞數較正常組、假手術組顯著增加（P＜0.05）（表1）。神經行為學評分6h和1d的評分結果明顯低于對照組，而注血后3d、5d、7d與2組神經行為學評分結果比較差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。腦組織含水量IVH組顯著高于正常組、假手術組（P＜0.05），術后6h開始升高，1d達高峰，在血腫吸收期（出血后3d）腦組織含水量呈逐漸下降（表3）。

表1 各組大鼠不同時間點LC內DBH陽性神經元數量比較 （±s）

表1 各組大鼠不同時間點LC內DBH陽性神經元數量比較 （±s）

注：與正常組、假手術組比較，＊P＜0.05

組別 術后各時間點6h 1d 3d 5d 7d正常組96±15 97±11 97±7 100±5 95±7假手術組 99±12 100±12 98±16 97±15 94±6 IVH組 208±9＊247±10 ＊218±22 ＊147±6 ＊121±8 ＊

表2 各組大鼠不同時間點神經行為學評分比較 （%，±s）

表2 各組大鼠不同時間點神經行為學評分比較 （%，±s）

注：與正常組、假手術組比較，＊P＜0.05

組別 術后各時間點6h 1d 3d 5d 7d正常組 87.00±2.5 88.25±2.76 86.25±1.7 88.25±4.4 87.5±4.0假手術組 86.5±4.6 87.75±3.6 87.00±2.2 88.25±4.3 87.5±4.2 IVH組 76.00±4.5＊66.00 ±2.5 ＊83.5 ±2.6 84.5±4.5 84.7±4.1

表3 各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較 （%，±s）

表3 各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較 （%，±s）

注：與正常組、假手術組比較，＊P＜0.05

組別 術后各時間點6h 1d 3d 5d 7d正常組 74.75±0.18 74.75±0.09 73±3.1 73.75±1.7 74.2 5±1.7假手術組75.25±0.95 74.25±0.96 73.75±2.61 74.5±0.13 74.25±1.8 IVH組 78.75±0.95＊ 83±0.85＊ 81.5±0.910＊ 77.5±1.3＊ 76.75±0.9＊

3 討論

藍斑（LC）位于三叉神經中腦核內側、第四腦室底與側壁交界處室底灰質的腹外側區，整個核團從面神經核平面一直延伸至中腦下丘平面尾側［4］。文獻［5］報道，由于LC獨特的色素沉著，很早就被人們在腦干內發現，但對其功能一直缺乏了解，直到用甲醛誘發熒光法發現LC含有兒茶酚胺（幾乎全部是NE），人們才認識到LC在機體的重要作用，是神經系統NE的最重要來源，同時50%的去甲腎上腺素能神經元分布在藍斑。NE以血液中酪氨酸為原料，在胞漿內首先羥化成多巴，再脫羧生成多巴胺（DA），然后DA進入囊泡，在囊泡內經多巴胺-β-羥化酶（DBH）催化生成NE。DBH是合成NE的關鍵酶，DBH免疫反應陽性不僅可以確定NE能神經元的性質、分布，而且一定程度上可根據免疫陽性產物量的多少及染色深淺確定去甲腎上腺素能神經元內DBH水平、NE含量及變化。因此，DBH是識別去甲腎上腺素能神經元的標志酶。

多種病理情況下，均會引起體內NE含量的改變，參與疾病的病理生理過程。IVH時，極易阻塞腦室系統引發顱內壓增高，尤其第三、四腦室積血鑄形和腦室擴大使得腦干重要結構受壓和破壞，而血腫本身及其分解產物也對腦干、下丘腦有直接損害作用，藍斑在上述情況下易受到損傷和刺激，去甲腎上腺素能神經元可被激活。激活的去甲腎上腺素能神經元廣泛的纖維上傳至杏仁體、邊緣皮質、新皮質致NE釋放，引起相應的反應；下傳到脊髓側角，調節交感神經及腎上腺髓質興奮，進而引起血漿中去甲腎上腺素濃度迅速上升，參與調控機體對應激的急性反應。本實驗中腦室出血后，腦干組織內NE含量急劇升高，加之腦室出血后藍斑-交感-腎上腺髓質系統興奮，合成和釋放大量NE，由于腦脊液循環受阻，腦脊液屏障（BBB）開放，血中NE可直接進入腦內，導致腦組織NE含量增加。

大量NE聚集在腦組織周圍，造成腦組織損傷的原因可能有：（1）激動α1受體-磷脂酶C系統或激動α2受體-腺苷酸環化酶抑制系統升高胞漿Ca2＋濃度，促進神經細胞內Ca2＋庫釋放增多，磷脂酶A2活化，花生四烯酸代謝后的物質可導致血管收縮，血小板凝集和血管通透性增加，進一步加重腦水腫［6］；（2）促進興奮性氨基酸（EAA）的釋放，增加N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）受體的敏感性，其結局是引起細胞外Ca2＋大量內流，細胞內Ca2＋超載，過度激活酯酶、激酶和內切酶，進而破壞細胞膜，神經纖維，造成神經細胞結構破壞；（3）通過激活神經元膜上的α1、β腎上腺素受體增加糖利用，提高組織代謝，使腦組織血流和代謝需求不相適應，加重組織乳酸酸中毒［7］；（4）NE可導致神經細胞過度興奮，加速能量消耗，使維持腦代謝活動的多種酶如Na＋-K＋-ATP酶活性降低，促使神經細胞內外離子分布異常，細胞內外滲透壓發生改變，激活位于胞膜上的水通道蛋白（AQP），進而促進水和電解質通過AQP4進入胞內導致細胞水腫［6］，從而引起和加劇腦細胞繼發性損害；（5）NE作用于腦內血管壁上α、β受體，使腦血管痙攣，加重腦缺血和水腫壞死；（6）大量NE使腦血管內皮細胞受到損傷，BBB開放，加劇腦水腫［8］；（7）血漿NE升高可直接作用于心血管系統，導致心臟泵血功能下降和外周血管收縮，從而導致腦灌注流量下降［8］，進一步加劇腦組織缺血缺氧；（8）NE有刺激腦細胞分泌腦鈉（BNP）的作用，導致低鈉血癥［9］，這可能與腦組織含水量顯著增加有關。因此，腦室出血后，更易損傷和刺激下丘腦、腦干組織，引起神經內分泌網絡功能紊亂，打破體內內環境平衡，導致一系列激素、神經遞質的含量發生病理性改變，對腦組織本身產生損害，同時也影響全身多器官的功能，誘發和加重多器官功能障礙綜合征（MODS），加重病情。

［1］彭建偉，許予明，劉強等.大鼠腦室系統出血模型的建立［J］.中華神經醫學雜志，2009，8（6）：563-566.

［2］Paxions G，Watson C.The rar brain in stereotaxic coordinates［M］.San Diego：Academic Press，1997：20-36.

［3］Hua Y，Schallert T，Keep RF，et al.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Stroke，2002，33（10）：2 478-2 484.

［4］賀桂瓊，孫善全，余會平，等.嗎啡依賴和戒斷大鼠脊髓內NA能神經元變化的研究［J］.第三軍醫大學學報，2005，27（24）：2 414-2 417.

［5］Parent A.Brain and cerebellum［M］／／Carpenter S.human neuroanatomy.9th ed.Philadelphia：Williams and Wilkins，1996：469-519.

［6］豐浩榮.腦出血后腦水腫形成機制研究進展［J］.腦與神經病學雜志，2008，16（2）：156-159.

［7］Hoffman WE，Shu CC.The interaction of glucose and sympathetic activity in stroke［J］.Stroke，1993，24（1）：165.

［8］許志強，蔣曉江，陳曼娥，等.單胺類遞質在大鼠腦出血心臟損傷中的作用［J］.腦與神經疾病雜志，2003，11（2）：81-82.

［9］Tomida M，Muraki M，Uemara K，et al.plasma concentration of brain natriuretic peptide in patients with subarachniod hemorrhage［J］.Stroke，1998，29（8）：1 584-1 587.