Caspase—3和神經生長因子在高膽紅素血癥腦損傷中的研究

劉榕 陰懷清

[摘要] 高膽紅素血癥可導致神經細胞的壞死或凋亡，最終引起不同程度的腦損傷。目前對凋亡的研究過程中，人們發現Caspase-3在誘導細胞凋亡的分子機制中有重要作用。神經生長因子是第一個被發現的神經營養因子，眾多研究表明：顱腦損傷后神經生長因子可保護受損的神經元，促進軸突定向再生，增加乙酰膽堿表達，改善膽堿能神經元功能，提高腦灌注，從而改善腦功能。本文主要對Caspase-3與神經生長因子在高膽紅素血癥腦損傷中的影響進行綜述。

[關鍵詞] 高膽紅素血癥；細胞凋亡；Caspase；神經生長因子

[中圖分類號] R722.17 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）31-0157-04

Study on Caspase-3 and nerve growth factor in brain injury in hyperbilirubinemia

LIU Rong1 YIN Huaiqing2

1.Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2.Department of Pediatrics，the Affiliated First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001， China

[Abstract] Hyperbilirubinemia can lead to neuronal cell necrosis or apoptosis，resulting in varying degrees of brain damage.At present，in the process of study on apoptosis，people found that Caspase-3 plays a key role in the molecular mechanism of inducing cell apoptosis.Nerve growth factor is the first discovered neurotrophic factor，numerous studies show that：after brain injury，nerve growth factor can protect damaged neurons，promote axon directed regeneration，increase the expression of acetylcholine，improve the function of cholinergic neurons and improve brain perfusion，thereby improving brain function.This article mainly reviewed the influence of Caspase-3 and nerve growth factor on brain injury in hyperbilirubinemia.

[Key words] Hyperbilirubinemia； Apoptosis； Caspase； Nerve growth factor

新生兒高膽紅素血癥是新生兒期最常見的問題，也是新生兒住院的主要原因之一，近年來發病率逐步上升，現高達30%～50%[1]。如治療不當可引發膽紅素腦病，即核黃疸（kernicterus），導致不同程度的腦損傷，輕則會導致遠期智商、情商低下、聽力損傷等，重則會造成新生兒死亡。有報道稱，約2/3存活患兒可遺留永久的神經系統后遺癥[2]，對新生兒的健康造成極大威脅。因此，深入研究高膽紅素血癥腦損傷的發病機制及防治措施，對其發病率的控制有重要意義。本文就Caspase-3與神經生長因子的結構、功能及其在高膽紅素血癥腦損傷中的作用進行綜述，有助于高膽紅素血癥腦損傷的研究。

1 Caspase-3與高膽紅素血癥腦損傷

1.1 Caspase

Caspase是在對哺乳動物細胞的凋亡進行研究時，人們發現的一組ICE（interleukin-1β convert enzyme，即Caspase-1）類蛋白，是一組半胱氨酸蛋白酶[3]，在細胞凋亡過程中有著關鍵作用，有以下共同點：①與Caspase-1有同源性；②其氨基端的一段序列被水解后可激活以無活性的酶原形式存在的底物；③底物中存在的天冬氨酸羧基端肽鍵在催化時斷裂[4]；④有高度保守五肽序列[5]；⑤Caspase被水解后可產生級聯放大效應；⑥Caspase家族一般有抑制劑[6，7]。目前至少16種Caspase在哺乳動物中被發現，根據其被發現的先后順序命名為Caspase-1～Caspase-16[6]。

1.2 Caspase-3與細胞凋亡

迄今為止，研究比較透徹的是作為主要的效應者分子的Caspass-3。人Capsape-3基因定位于染色體4q33-q35處。目前眾多研究表明，在哺乳動物細胞凋亡中Caspase-3是關鍵蛋白酶，且Caspase-3活化后可通過3種途徑導致細胞解體[8]：①裂解胞內的骨架蛋白和胞外的細胞外基質，如肌動蛋白、角質蛋白等。②裂解凋亡抑制物，如核酸內切酶抑制劑（ICAD/DFF45）、Bcl-2等。③DNA修復相關分子的裂解，如DNA依賴性蛋白激酶。

底物被酶解失活后會導致細胞的形態、功能發生一系列變化，表現為細胞皺縮，胞質致密，核染色質邊集，而后胞核裂解，胞質生出芽突并脫落，形成核碎片和（或）細胞器成分的膜包被小體，即凋亡小體。凋亡現象在本質上是一系列Caspase的級聯切割過程。

1.3 高膽紅素血癥腦損傷機制

膽紅素可引起神經細胞凋亡增加，已在體內外實驗中得到肯定，但引起凋亡的具體發病機制仍不清楚，其可能機制如下：

1.3.1 Ca2+超載 各種原因引起的細胞內鈣含量異常增多并導致細胞結構損傷和功能代謝障礙的現象稱為鈣超載。眾多研究表明[9，10]，胞質中Ca2+濃度的升高與細胞凋亡（apoptosis，AP）之間存在著密切的聯系。膽紅素進入腦組織后可能通過影響細胞膜對鈣離子的通透性，影響膜上鈣泵的活性等使細胞內形成鈣超載現象，從而導致細胞凋亡。

1.3.2 影響線粒體呼吸功能 線粒體中有許多非常重要的蛋白酶或蛋白質，它們與細胞凋亡直接相關，如凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）、細胞色素C[11]、Bcl-2家族成員、半胱氨酸水解酶[12]等，它是真核細胞的動力加工廠，在介導細胞凋亡的信號轉導過程中起著重要作用。Schif等通過實驗發現細胞中膽紅素發揮其毒性作用的最初部位是線粒體。50年代，Zeterstron和Ernster發現，能達到抑制小鼠肝、腦細胞線粒體的磷酸化及生物氧化作用的膽紅素濃度是300M。Rodrigues等[13]通過實驗證實解離線粒體氧化磷酸化是膽紅素的主要毒性作用，膽紅素可改變線粒體膜的通透性，導致細胞色素C釋放，再作用于一些激酶和水解酶，啟動神經細胞凋亡。

因此，膽紅素通過造成胞內Ca2+超載，影響線粒體的呼吸功能從而造成神經細胞的凋亡[14]。動物實驗結果顯示：高膽紅素血癥可誘導模型鼠腦組織Caspase-3表達增加，Caspase-3的表達在造模后24 h后出現高峰，表明過多的Caspase-3參與了高膽紅素血癥腦損傷的發生[15]，但在此分子鏈中具體的信號傳導機制及過程尚未完全闡明。

2 神經生長因子及其對中樞神經損傷的保護作用

2.1神經生長因子簡介

神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是第一個被發現的神經營養因子，目前為人們所熟悉的經典的NGF是從小鼠頜下腺分離所得，其相對分子質量為140×103，是一種蛋白質，由118個氨基酸組成，由以非共價鍵結合的一個β亞單位、兩個α亞單位及兩個γ亞單位組成，其分子組成中含有2個鋅原子，增加了分子的穩定性，其中有活性的亞基是β亞單位[16，17]。目前，人類NGF的基因序列已經明確，研究表明：人類NGF與小鼠NGF有90%的同源性[18]。NGF通過與其受體的結合發揮作用，哺乳動物中存在兩種可與NGF結合的跨膜受體，即高親和力受體酪氨酸激酶受體（TrkA）和低親和力受體p75NTR。當TrkA和p75NTR共同存在時，p75NTR可通過增加TrkA與NGF的親和力促進神經細胞軸突的生長，但當p75NTR單獨存在時，則會介導細胞的凋亡[19]。

2.2 NGF對中樞神經損傷的保護作用

顱腦損傷后，應用外源性NGF可促進神經纖維再生，誘導軸突定向生長，修復受損的神經元。黃莉等[20]通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦病模型，應用外源性NGF對其進行干預，證實新生大鼠缺氧缺血后，NGF可使其皮質和海馬部位的神經細胞凋亡明顯減輕，腦組織病理及超微結構改變均減輕。龍琦等[21]用神經生長因子（NGF）、外源性堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）及二者聯合用藥分別對缺氧缺血腦損傷（HIBD）新生大鼠進行干預后發現，NGF、bFGF均可提高HIBD后海馬區神經元的數量；而二者聯合應用則可明顯提高神經元的數量。孔祥梅等[22]的進一步研究中，先用谷氨酸造成體外培養的大腦基底神經節神經元損傷，再用NGF干預，發現NGF保護組大腦基底神經節GAP-43mRNA和NF-L表達較對照組高，差異有統計學意義。GAP-43在神經系統正常活動所必需的軸漿運輸中有重要作用，而軸漿運輸與神經再生及損傷后修復有密切關系，表明NGF可促進神經元再生。同時，Ziemba等[23]的研究移植神經定向生長的實驗中，將載有神經生長因子基因序列的病毒載體植入特定區域，發現隨著NGF的表達，植入大鼠胼胝體處的背根神經元有向高濃度NGF區域生長的趨勢。Jin Y等[24]也證實在顱腦損傷時，通過復合介導途徑，NGF可使軸突通過損傷區生長。以上研究證實了NGF的神經元保護作用，其具體機制可能如下：

2.2.1 拮抗自由基作用 神經細胞內含有許多自由基清除劑，如過氧化物歧化酶、過氧化氫酶等，顱腦損傷致白細胞活化后會釋放一些對細胞有害的細胞因子，如IL-6和氧自由基等，而這些有害的細胞因子反過來又會加重腦損傷。周政等[25]用NGF對大鼠轉基因后研究發現，與對照組相比，NGF轉基因大鼠發生短暫腦缺血損傷后，其腦皮質、海馬區中神經細胞的凋亡明顯減少，而一些自由基清除劑如銅鋅超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等的含量明顯增高。也有實驗證明[26]：NGF可通過增加自由基清除劑的活性，減輕顱腦損傷時神經元的凋亡。

2.2.2 細胞內ca2+水平的穩定 腦缺血腦損傷后，通過促進氧自由基生成、加重酸中毒、破壞細胞膜等途徑可使細胞內形成Ca2+超載現象，從而引起神經元的壞死或凋亡。有研究表明[27]：離體細胞在外源性H2O2存在時，胞內Ca2+會明顯增加，而（1～100）μg/L的NGF可抑制低濃度H2O2（0.05 mmol/L）引起的Ca2+升高，且呈劑量依賴性，提示NGF通過穩定細胞內Ca2+的水平來保護損傷神經元。Cheng等[28]認為其原因可能是NGF增強細胞排出及緩沖Ca2+的能力，提示NGF能通過影響那些調節Ca2+內流的蛋白質（如谷氨酸受體、電壓依賴Ca2+通道、Na+和K+通道等）的表達及功能，發揮其對神經元的保護作用。

2.2.3 拮抗興奮性氨基酸的神經毒性 興奮性氨基酸中與缺血性腦損傷有關的主要是谷氨酸，正常情況下參與中樞神經系統的信息傳遞，但過量的谷氨酸會損傷神經元。當谷氨酸濃度升高時，通過NMDA信號傳導途徑使細胞內形成Ca2+超載現象，進而導致細胞凋亡[29]。王艷輝等[30]的實驗證明：與興奮性氨基酸毒性作用有關的小腦細胞凋亡，可被濃度為50 μg/L、l00 μg/L的NGF緩解，因某些單核細胞能夠分泌NFG。Zassler等[31]將這類單核細胞移植入模型動物體內后，研究發現，與對照組相比，移植組中通過NMDA途徑導致的膽堿能神經元凋亡數目明顯減少，表明NGF可通過拮抗興奮性氨基酸的神經毒性實現對神經元的保護。

3 Caspase-3與NGF中樞神經元保護作用的相關性

我們知道，發生高膽紅素血癥腦損傷時，可導致神經元凋亡，Caspase-3是Caspase家族中與細胞凋亡關系最密切的，并在其中發揮著重要作用，而NGF對受損的中樞神經元有明確的保護作用，為了研究中樞神經損傷時受到NGF干預后腦組織中Caspase-3的表達變化，人們進行了大量實驗。葛洪亮等[32]在大鼠脊髓損傷后用蛇毒神經生長因子進行干預發現，與對照組相比，干預組損傷脊髓組織中 Caspase-3蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義。張彥等[33]用神經生長因子對紅藻氨酸（KA）致癲癇大鼠進行干預，發現NGF能有效抑制其海馬區Caspase-3的表達，發揮其腦損傷保護作用。有實驗表明[34]，大鼠腦缺血再灌注后，腦內Caspase-3表達增多，并于再灌注后24 h達到高峰，與對照組相比，Caspase-3在NGF干預組腦組織中表達減少。也有研究表明[35]，NGF可通過下調c-jun mRNA及Caspase-3蛋白的表達，減少缺血神經元的凋亡。也有人用神經生長因子、外源性降鈣素基因相關肽（CGRP）以及二者聯合分別對短暫性全腦缺血后再灌注大鼠進行干預，發現NGF和CGRP均可抑制全腦缺血后大鼠紋皮質Caspase-3蛋白表達，聯合應用則能顯著抑制Caspase-3表達，提示NGF和CGRP通過抑制Caspase-3蛋白表達對缺血神經元起保護作用，且二者對保護缺血神經元可能有協同作用[36]。

以上結論表明：NGF可通過抑制Caspase-3的表達實現對神經元的保護，但NGF如何對Caspase-3進行作用尚不完全清楚，可能與NGF的拮抗興奮性氨基酸的神經毒性、穩定細胞內Ca2+水平及增加自由基清除劑的活性等作用有關。可以猜想，在高膽紅素血癥腦損傷致細胞凋亡的過程中，有Caspase-3的參與，如果用外源性NGF進行干預，有可能降低腦組織中Caspase-3蛋白的表達，從而延緩甚至阻斷高膽紅素血癥腦損傷的發展，而有關NGF如何影響高膽紅素血癥腦損傷腦組織中Caspase-3表達的報道目前仍比較少，這些都有待進一步研究。

4 前景及展望

近年來，高膽紅素血癥腦損傷的發生發展過程及其防治措施逐漸成為研究熱點，但相關報道目前仍比較少。眾多體內外實驗表明，過量膽紅素可加速神經細胞凋亡，且Caspase-3在其中有關鍵作用，但具體的分子機制并不清楚，而NGF的神經元保護作用雖然明確，但其分子機制尚未完全闡明，尤其是在高膽紅素血癥腦損傷中，NGF對損傷腦組織中Caspase-3表達的影響及其作用機制仍需進一步研究。因此，高膽紅素血癥腦損傷后腦組織中Caspase-3的表達變化研究及神經生長因子的神經元保護機制研究，有助于對高膽紅素血癥腦損傷發生發展過程的進一步認識，有望探索出一條可行的高效準確的干預通路，以盡可能減輕過量膽紅素造成的腦損傷，甚至一定程度上阻止高膽紅素血癥腦損傷的發展。

[參考文獻]

[1] 黃德珉. 新生兒黃疸[J]. 新生兒科雜志，1995，10（4）：148-150.

[2] 孫長琴. 新生兒高膽紅素血癥研究新進展[J]. 海南醫學，2009，20（5）：296-299.

[3] 趙瑞杰. Caspase 家族與細胞凋亡的關系[J]. 中國畜牧雜志，2010，46（17）：73-78.

[4] 袁長青，丁振華. Caspase的結構和功能[J]. 國外醫學：分子生物學分冊，2002，24（3）：146-151.

[5] Cohen GM. Caspase：The executioners of apoptosis[J]. J Biol Chem，1997，326（ Pt1）：1-16.

[6] Thom bcrry NA，Yuril. Caspase enemies within[J]. Science，1998，281（8）：131-135.

[7] Marks N. Caspase-9 interations in the developing nervous system：Evidence for multipie death pathway[J]. Neurochem Int，1999，35（3）：195-197.

[8] Joseph EK，Levine JD. Caspase signal lingin neuro path can din flammatory painin therat[J]. Eur J Neurosci，2004，20（11）：2896-2902.

[9] Blagosklonny MV，Chuman Y，Bergan RC，et al. Mitogen activated protein kinase pathway is dispensable for microtubule active drug induced Raf-1 Bcl-2[J]. Leukermia，1999， 13（7）：1028-1036.

[10] Dimitrov T，Krajcsi P，Hermiston TW，et al. A clenovirus protein complex inhibits tumor necrosis factor induced translocation of cytosolis phospholipase to membranes[J]. J Virol，1997，71（4）：2830-2837.

[11] Liu X，Kin CN，Yang J，et al. Induction of apoptotic program in cell free extracts：Requirement for d-ATP and cyto chrome C[J]. Cell，1996，86（7）：147-157.

[12] Krajewska S，Krajewska S，Krajewski M，et al. Release of Capase-9 from mitochondria during neuronal apoptosis and cerebral ischemia[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999， 96（10）：5752-5757.

[13] Rodrigues CM，Sola S，Silva R. Bilirubin and amyloid beta peptide induced cytochrome C release through mitocondrial membrane permeabilization[J]. Mol Med，2000，6（11）：936-946.

[14] David G，Kirsch DG，Andrea DB，et al. Capase-3 dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome C[J].J Biol Chem，1999，274（30）：21155-21161.

[15] 王曉琴. 高膽紅素血癥新生大鼠腦組織激活素A、caspase-3表達的研究[J]. 中華神經醫學雜志，2008，7（3）：262-266.

[16] 溫博貴. 神經生長因子：分布、化學及功能[J]. 生理科學進展，1981，12：132-138.

[17] 于肇英. 神經生長因子的研究[J]. 生理科學進展，1988， 19（3）：226-230.

[18] Ullrich A，Gray A Berman C，et al. Human beta-nerve growth factor gene sequence highly homologous to that of mouse[J]. Nature，1983，303（5920）：821-825.

[19] 黃秉仁，蔡良琬. 神經生長因子家族及其受體研究進展[J]. 生理科學進展，1995，2：115-120.

[20] 黃莉，蔣犁，緲紅軍. 神經生長因子對新生大鼠腦神經元細胞缺氧缺血損傷的保護作用[J]. 中國臨床康復，2005，45：82-84，198.

[21] 龍琦，尹曉娟，封志純. 神經生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對缺氧缺血腦損傷新生大鼠內源性神經干細胞的影響[J]. 實用醫學雜志，2009，25（1）：36-39.

[22] 孔祥梅，黃飛，陳立東，等. 神經生長因子對體外培養大腦基底神經節神經元的保護作用[J]. 解剖學雜志，2007，30（2）：182-185.

[23] Ziemba KS，Chaudhry N，Rabchevsky AG，et al.Targeting axon growth from neuronal transplants alongpreformed guidance pathways in the adult CNS[J]. J Neurosc，2008， 28（2）：340-348.

[24] Jin Y，Ziemba KS，Smith GM. Axon growth across a lesion site along a preformed guidance pathway in the brain[J]. Exp Neurol，2008，210（2）：521-530.

[25] 周政，陳惠孫，張可成，等. 神經生長因子對顱腦損傷后神經細胞的保護作用[J]. 中華實驗外科雜志，2004， 21（5）：588-589.

[26] 李強，王冬陽. 神經生長因子與腦缺血[J]. 錦州醫學院學報，2004，25（2）：52-54.

[27] 吳俊芳，張均田. 神經生長因子對新生大鼠腦細胞內游離鈣濃度的影響[J]. 中國臨床藥理學與治療學雜志，1997，4：241-244.

[28] Cheng B，McMahon D，Mattson MP. Modulation of calcium current，intracellular calcium levels and cell survival by hypoglycemia，NGF and bFGF in cultured hippocampal neurons[J]. Brain Res，1993，607：275-285.

[29] Darzynkiewicz Z，Brino S，Bino GD，et al. Features of apoptotic cells measured by flow eytometry[J]. Cytometey，1999，13（5）：795-808.

[30] 王艷輝，趙冬寶，趙春玉，等. 神經生長因子對新生的大鼠小腦皮質神經細胞凋亡的影響[J]. 中國臨床康復，2005，9（9）：50-51.

[31] Zassler B，Humpel C. Transplantation of NGF secreting primary monocytes. Counteracts NMDA-induced cell death of rat cholinergic neurons in vivo[J]. Exp Neurol，2006，198（2）：391-340.

[32] 葛洪亮，賀茂林，李世德. 蛇毒神經生長因子對大鼠脊髓損傷后Caspase-3表達影響[J]. 蛇志，2011，23（2）：111-113.

[33] 張彥，朱鳳蓮. 神經生長因子對紅藻氨酸致大鼠海馬神經細胞半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶-3表達的影響[J]. 實用兒科臨床雜志，2010，25（4）：282-284.

[34] 張宇. 神經生長因子對大鼠腦缺血再灌注后caspase-3及AngⅡ表達的影響[D]. 大連醫科大學，2008.

[35] Dacheng Jin. Nerve growth factor downregulatesc-jun mRNA and Caspase-3 instriate cortex of rats after transient globalcerebral ischemia/reperfusion[J]. Neural Regeneration Research，2006，4：289-292.

[36] 金大成，王鐵民，方秀斌. CGRP和NGF對短暫性全腦缺血后再灌注大鼠紋皮質Caspase-3蛋白表達的影響[J].神經解剖學雜志，2004，20（3）：296-300.

（收稿日期：2015-09-15）