c-Kit＋Lin－細(xì)胞移植改善急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究

張守華楊慎華楊文萍徐紅艷雷俊黃慧劉志強(qiáng)陶強(qiáng)★

·論著·

c-Kit＋Lin－細(xì)胞移植改善急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究

張守華1楊慎華2楊文萍3徐紅艷3雷俊1黃慧3劉志強(qiáng)3陶強(qiáng)1★

目的探討骨髓c-Kit＋Lin－（CD117）細(xì)胞移植治療小鼠急性肝損傷的效果以及機(jī)制，為骨髓源性肝干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法18只成年BALB／c小鼠隨機(jī)分為正常組、實(shí)驗(yàn)組和干細(xì)胞移植組，正常組不予任何處理，模型組小鼠腹腔注射CCl4后僅輸入生理鹽水，移植組小鼠在腹腔注射CCl4后尾靜脈輸注骨髓CD117細(xì)胞（1×106），48 h后觀察各組小鼠肝功能水平變化，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色分析肝臟病理學(xué)改變，免疫組化檢測肝臟細(xì)胞增殖情況。結(jié)果模型組腹腔注射CCl4后肝功能嚴(yán)重受損，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transam inase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutam ic oxalacetic transaminase，AST）、膽紅素（bilirubin）等升高，肝臟的HE染色可見片狀壞死，炎癥細(xì)胞浸潤；移植組小鼠移植干細(xì)胞48 h后小鼠肝功能有所恢復(fù)，病理提示肝臟壞死區(qū)域有所減小，Ki67免疫組化提示干細(xì)胞可促進(jìn)肝臟再生。結(jié)論經(jīng)尾靜脈注入的骨髓來源的CD117干細(xì)胞能改善急性肝損傷肝功能以及修復(fù)受損肝臟，是治療急性肝損傷的一種安全有效的方法。

骨髓c-Kit＋lin－細(xì)胞；肝干細(xì)胞；急性肝損傷

眾多學(xué)者已經(jīng)證實(shí)骨髓來源的干細(xì)胞可分化為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞等［1］。本課題組總結(jié)以往的研究成果，并結(jié)合自己的前期研究，發(fā)現(xiàn)在骨髓干細(xì)胞群中c-kit＋Lin－（CD117）干細(xì)胞群具有很強(qiáng)的向肝細(xì)胞分化的能力［2－3］，并且已經(jīng)在以往的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)可以分化為肝細(xì)胞并且改善肝纖維化小鼠的肝功能以及肝纖維化病變程度。但是CD117細(xì)胞是否可以改善急性肝損傷目前報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用CCl4建立急性肝損傷模型，探討移植CD117細(xì)胞是否有改善肝損傷作用以及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 免疫磁珠法分離骨髓c-kit＋Lin－細(xì)胞

取10只Balb／c小鼠，無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級，5周齡～6周齡、體質(zhì)量15 g～18 g，購自南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠頸椎脫臼處死，置75％的乙醇浸泡15m in；無菌取出解剖雙側(cè)股骨，離斷兩端骨骺，PBS反復(fù)沖洗骨髓腔；細(xì)胞懸液吹打后加入紅細(xì)胞裂解液6m L，30μm 400目尼龍膜過濾，獲取細(xì)胞懸液。利用德國M iltenyi Biotec公司lin-細(xì)胞單抗分離系統(tǒng)先分離富集lin-細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上再陽性分選出c-kit＋細(xì)胞，最后富集得到CD117細(xì)胞。分離方法按c-kit＋以及Lin-試劑盒（德國M iltenyi Biotec公司）說明書進(jìn)行。利用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測分選的CD117細(xì)胞，其純度為90％以上，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力超過95％。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和分組

小鼠急性CCl4肝損傷模型的建立：取BALB／c小鼠18只，雌雄各半，自由飲水及進(jìn)食。采用橄欖油作溶劑，將CCl4溶于橄欖油中，配成10％（V／V）CCl4橄欖油。

小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只：正常組僅僅腹腔注射300μL／kg橄欖油；模型組腹腔注射10％ CCl4300μL／kg；移植組腹腔注射10％CCl4300 μL／kg后1 h給予尾靜脈注射新鮮分選的CD117細(xì)胞，移植數(shù)量為1×106／只。

1.3 移植后的觀察

移植后48 h，取各組小鼠肝組織行常規(guī)組織病理學(xué)檢查蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，同時(shí)眼球取血檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transam inase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（glutam ic oxalacetic transam inase，AST）、白蛋白（album in，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）等肝功能指標(biāo)。

免疫組織化學(xué)法檢測Ki67：肝組織切片厚度4μm，常規(guī)脫蠟至水化，微波對抗原修復(fù)，5％的羊血清封閉非特異性蛋白，加Ki67第一抗體，37℃恒溫孵育30m in，再置4℃冰箱過夜；加第二抗體，37℃恒溫孵育30m in；采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP），DAB顯色，陽性染色的細(xì)胞為棕黃色或棕褐色。用光學(xué)顯微鏡觀察Ki67在肝組織中的分布情況以及表達(dá)指數(shù)：取3張不連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，取其均值，計(jì)算Ki67陽性表達(dá)指數(shù)，即陽性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100％。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間數(shù)據(jù)的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的多個(gè)樣本均數(shù)比較。方差不齊時(shí)采用Tamhane檢驗(yàn)。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)變化

正常組小鼠肝臟顏色為暗紅色，表面光滑，有光澤，HE染色可見肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，結(jié)構(gòu)清晰，未見炎性細(xì)胞浸潤，肝索排列整齊（圖1）。模型組小鼠肝臟肝HE染色可見肝細(xì)胞片狀壞死（箭頭所示），細(xì)胞索紊亂，肝小葉中心帶肝細(xì)胞胞漿腫大疏松，脂肪樣變，炎性細(xì)胞浸

潤（圖2）。移植CD117細(xì)胞48 h后，HE染色可見移植組小鼠肝臟壞死區(qū)域減小，肝細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，氣球樣變性減輕（圖3）。

圖1 正常組小鼠肝組織（HE×400）Figure 1 Liver tissue of normal group（HE×400）

圖2 模型組小鼠肝組織（HE×200）Figure 2 Liver tissue ofmodel group（HE×200）

圖3 移植組小鼠肝組織（HE×200）Figure 3 Liver tissue of transplantion group（HE×200）

圖4 移植組肝組織ki67的表達(dá)（×400）Figure 4 Ki67 in liver of transplantion group（×400）

圖5 正常組肝組織ki67的表達(dá)（×200）Figure 5 Ki67 in liver of normalgroup（×200）

圖6 模型組肝組織ki67的表達(dá)（×200）Figure 6 Ki67 in liver ofmodel group（×200）

2.2 肝功能變化

移植48 h后移植組與模型組相比，肝功能均有改善，AST、ALT、ALB以及TBIL均有所恢復(fù)（表1）。

表1 肝功能相關(guān)指標(biāo)的變化Table1 The changes of liver function related indices

2.3 Ki67蛋白在各組肝組織中的表達(dá)

Ki67陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿均不染色。免疫組化結(jié)果顯示移植組（圖4）ki67的表達(dá)指數(shù)（4.0±1.0）明顯高于正常組（0.9±0.2）（P＝0.001）（圖5）以及模型組（1.9± 0.4）（P＝0.005）（圖6）。

3 討論

自從骨髓中的干細(xì)胞能夠在體內(nèi)外分化成為肝細(xì)胞的現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)之后，越來越多的研究證實(shí)了肝臟干細(xì)胞在治療肝臟疾病的有效性［3］。CD117細(xì)胞即為骨髓衍生肝干細(xì)胞（bonemarrow derived liverstem cells，BMDLSC），我們在以往干細(xì)胞治療肝纖維化的前期工作已經(jīng)初步證實(shí)了c-kit＋Lin－（CD117）細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的能力較強(qiáng)，移植入肝纖維化模型鼠體內(nèi)可以改善病變過程，在一定程度上能恢復(fù)肝功能。本實(shí)驗(yàn)將CD117細(xì)胞移植入急性肝損傷小鼠體內(nèi)，觀察其對急性肝損傷是否有治療效果。

目前，CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭是國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)可和使用的動物模型。CCl4對肝臟毒性作用的機(jī)制復(fù)雜，與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。當(dāng)CCl4進(jìn)入肝細(xì)胞后，經(jīng)過細(xì)胞色素P450酶代謝激活，產(chǎn)生三氯甲基自由基（CCl3-）和過氧化三氯甲基自由基（OOCCl3-），這些自由基與肝細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上的磷脂分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損害膜的結(jié)構(gòu)和功能以及鈣泵的活性，引起能量代謝障礙，導(dǎo)致細(xì)胞損傷［4－5］。細(xì)胞損傷壞死刺激炎癥細(xì)胞募集，釋放炎性介質(zhì)，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞。膜結(jié)構(gòu)的破壞使胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST溢出，使血漿中的ALT、AST等升高，在一定程度上反映了肝細(xì)胞的損傷程度［6－7］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CCl4腹腔注射建立小鼠急性肝損傷模型，注射后小鼠轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示建模成功。

Ki67是一種與細(xì)胞分裂及增殖有關(guān)的蛋白，只在增殖細(xì)胞中表達(dá)，定位于細(xì)胞核，參與細(xì)胞周期調(diào)控，可準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖情況。Ki67基因定位于第10號染色體的長臂（10q25）上，其表達(dá)出現(xiàn)在G1中期到晚期，在S期和G2期逐漸增加，且有絲分裂達(dá)到高峰，離開增殖周期后迅速降解或者抗原決定簇丟失，在G0期消失［8］。由于Ki67半衰期短，僅1 h或更短，能有效地檢測細(xì)胞的增殖活性與水平，出現(xiàn)假陰性或假陽性的概率較低［9］。因此本實(shí)驗(yàn)采用Ki67作為肝臟損傷后肝臟再生、修復(fù)的一個(gè)重要指標(biāo)。

在本研究中，考慮到免疫排斥因素，供體和受體均采用近交系的BALB／c小鼠，移植途徑選擇從尾靜脈注入，移植過程安全、方便。移植組在接受CD117細(xì)胞移植后，結(jié)果顯示肝功能與模型組相比有所恢復(fù)，AST和ALT均下降，ALB有所升高。腹腔注射CCl4后，模型小鼠肝臟病理可見眾多區(qū)域的片狀壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞胞漿氣球樣變；而移植組小鼠肝臟片狀壞死區(qū)域減小，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，ki67免疫組化也顯示移植組陽性率明顯高于模型組，提示移植的CD117干細(xì)胞可促進(jìn)肝臟再生。我們的前期研究提示，CD117細(xì)胞體內(nèi)移植后，需要一周以上的時(shí)間才能分化為肝樣細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)移植時(shí)間僅僅48 h，由此推論其改善肝功能并非通過定向分化這條途徑。我們推測肝細(xì)胞壞死以及炎性細(xì)胞浸潤所釋放的炎性介質(zhì)促使CD117細(xì)胞歸巢于肝臟，在肝臟定居后分泌細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長因子、表皮生長因子等從而促進(jìn)肝臟再生。有文獻(xiàn)報(bào)道來源于脂肪的間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌IL-18保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷［10］，CD117細(xì)胞刺激肝細(xì)胞的再生其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

急性肝損傷是短期時(shí)間內(nèi)由于各種因素如用藥不當(dāng)、病毒、肝臟缺血再灌注、食物添加劑、乙醇攝入過多及接觸、食入有毒食物、放射性損傷等誘發(fā)的肝細(xì)胞變性壞死，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶的升高，白蛋白下降，可導(dǎo)致肝臟不可逆的損傷，嚴(yán)重的可合并肝腎綜合征、肝性腦病，凝血功能障礙，甚至導(dǎo)致個(gè)體死亡［11］。近年來干細(xì)胞的研究在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中取得的進(jìn)展為肝臟疾病的治療提供了新的契機(jī)。本實(shí)驗(yàn)所研究的CD117干細(xì)胞為造血干細(xì)胞的一種，肝臟與造血之間存在天然的內(nèi)在聯(lián)系，在胚胎發(fā)育過程中，胎肝是主要的造血器官，也是造血干細(xì)胞生存的場所，已有眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)造血干細(xì)胞向肝細(xì)胞橫向分化是可行的［12］。骨髓中存在著與肝臟相同標(biāo)志的干細(xì)胞如c-Kit、CD34、Thy-1＋等［13－14］，本實(shí)驗(yàn)所研究的CD117細(xì)胞即是此類細(xì)胞的一種，發(fā)現(xiàn)其有效的輔助治療了急性肝損傷，為肝臟疾病的治療開辟了新的領(lǐng)域。

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The study of transp lantation of c-Kit＋Lin-cell for treatment of acute liver injure

ZHANG Shouhua1，YANG Shenhua2，YANG Wenping3，XU Hongyan3，LEI Jun1，HUANG Hui3，LIU Zhiqiang3，TAO Qiang1★
（1.Department of General Surgery，Children’s Hospital of Jiangxi Province，Nanchang，Jiangxi，China，330006；2.Institute of Occupational Medicine of Jiangxi Province，Nanchang，Jiangxi，China，330006；3.Department of Pathlogy，Children’s Hospital of Jiangxi Province，Nanchang，Jiangxi，China，330006）

Objective To investigate the effects of bone marrow c-Kit＋lin－cell（CD117）transplantation on acute liver injury micemodel and provide experimental basis for clinical application.Methods 18 BALB／c mice were random ly divided into 3 groups：normal group，experiment group and stem cell transplantation group.In normal group，the m ice did not give any processing.In experiment group，the CCl4was injected intraperitoneally，and then infused saline.In stem cell transplantation group，the m ice injected bone marrow CD117 cell（1×106）via tail vein after CCL4intraperitoneal injection.The liver functional was measured after 48 hours.The liver histologic changes were assessed by hematoxylin-eosin（HE）staining.The hepatocyte proliferation was assessed by immunohistochem ical.Results The liver functional of experiment group was severely damaged after CCL4intraperitoneal injection.The expressions of alanine transaminase（ALT），glutam ic oxalacetic transam inase（AST）and bilirubin in experiment group increased.The HE staining revealed extensive hepatocellular necrosis in mice subjected to CCL4intraperitoneal injection.In stem cell transplantation group.The liver function was recovered after 48h of stem cell transplantation，and the

Bonemarrow c-Kit＋Lin－cell；Hepatic stem cell；Acute liver injury

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃（20155568）；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（20112BBG70069）

1.江西省兒童醫(yī)院普外科，江西，南昌330006 2.江西省職業(yè)病防治研究院，江西，南昌330006 3.江西省兒童醫(yī)院病理科，江西，南昌330006

★通訊作者：陶強(qiáng)，E-mail：taoqiang_2008＠126.com

area of necrosis was significantly lower.The Ki67 expressions indicated the stem cell can improve hepatocyte proliferation.Conclusion Inject bonemarrow CD117 cell via tail vein can protect the liver from acute liver injury and repair the damaged liver.It can be considered as a therapeutic option to prevent acute liver injury.